小鼠基因敲除的研究进展

随着人类基因组计划(HGP)的顺利完成,后基因时代的生物学研究迫切需要一种有效的基因功能分析方法。基因敲除小鼠模型的应用,为研究基因的功能和寻找新的治疗人类疾病的干预措施提供了有力支持。基因打靶和基因捕获是两种不同的通过胚胎干细胞(ES细胞)制作基因敲除小鼠的技术。基因捕获具有高通量、随机性、序列标记等特点,而基因打靶则是针对特定基因的敲除。自基因打靶和基因捕获小鼠首次亮相距今已有近20年的时间。近年来,针对基因打靶和基因捕获的新工具不断涌现,并且相应的组织也已经成立。这些组织能够利用这两种方法敲除小鼠基因组中的基因。国际基因捕获协会(The International Gene Trap Consortium,IGTC)和基因敲除小鼠计划(The Knockout Mouse Project,KOMP)已着手创建世界范围内用于科研的便利资源,并且计划敲除所有小鼠的基因。KOMP的组织者认为这与HGP一样具有重要意义。从传统的基因打靶到现在的高通量的条件基因打靶,基因打靶的方法已经发生了很大的变化。捕获和打靶两者的组合优势大大提升了基因捕获的范围和基因打靶的效率。作为一种新开发的插入式突变系统,转座子在捕获基因方面比逆转录病毒更具有优势。国际基因敲除小鼠协会(The International Knockout Mouse Consortium,IKMC)的出现标志着全球性合作的开始。该组织致力于系统地敲除小鼠基因组中所有基因,进而开展功能基因组的研究。     

小鼠Bpi条件基因打靶载体的构建和鉴定

目的构建小鼠Bpi条件基因打靶载体,为建立Bpi条件基因打靶小鼠模型和深入研究Bpi基因功能奠定基础。方法采用Cre/LoxP系统,选择小鼠Bpi基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入LoxP位点;运用LA-PCR技术,以129品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括Bpi第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1 kb基因片段以及下游同源臂4.9 kb基因片段;构建pBSKⅡ-5SLoxP和ploxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1 kb)与酶切后的ploxPFRTNeo-3L质粒相连获得Bpi条件基因打靶载体。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的pBSKⅡ-5SLoxP、ploxPFRTNeo-3L重组质粒和Bpi条件基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Bpi条件基因打靶载体。     

体细胞多位点基因打靶技术的研究

该研究利用多拷贝序列作为靶位点进行多位点基因打靶技术的研究。通过显微切割、菌落杂交、Southern杂交等方法获得人类D，G组染色体短臂多拷贝序列（DGMS），然后利用DGMS构建含Neo/TK基因正负选择系统的基因打靶载体。采用电穿孔、G418和GCV筛选进行Neo基因的基因打靶，并经PCR，FISH定位，Neo基因表达等证实Neo基因定点整合到D，G组染色体短臂且表达；最终建立了一种有效的、多个安全位点的基因打靶技术。该技术可应用于体外细胞和动植物的转基因，甚至人类的基因治疗。     

基于博来霉素抗性筛选的核糖体DNA通用基因打靶载体平台的构建

目的:构建一个基于博来霉素筛选的核糖体区基因打靶载体,为后续的基因打靶研究奠定基础.方法:首先选择含有博来霉素(zeocin)抗性的目的片段与载体连接,并进行单酶切及测序鉴定,最终构建基于博来霉素筛选核糖体基因打靶载体平台.结果:构成pUC19-DS1-SV40-Zeocin-polyA-DS2基因打靶载体与预期一致,测序结果与实验设计相同.结论:成功构建了含有抗性基因的pUC19-DS1-SV40-Zeocin-polyA-DS2水牛基因通用打靶载体平台,便于不同外源基因的插入,为转基因动物模型的建立提供了基础工具.     

位点特异性DNA内切酶在植物基因打靶中的应用

基因打靶是在基因组指定位点插入、删除和替换DNA序列的技术。由于同源重组频率低,在植物中高效的基因打靶技术一直未被建立,制约了植物基因功能和分子育种的研究。近年来,人工设计的锌指蛋白和TAL效应因子DNA结合结构域实现了对全新DNA序列的识别。人工设计的DNA结合结构域连接核酸内切酶能在基因组指定位点创造双链DNA断裂,进而产生定点突变和促进同源重组。笔者重点介绍锌指核酸酶和TAL效应因子核酸酶在植物基因组定点突变和基因打靶中的研究进展,并对目前存在的问题进行分析。     

通用型奶牛多位点基因打靶载体系统的构建

以奶牛为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点,基于BAC重组酶系统构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料.首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GD表达载体.将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GD表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GD质粒,采用归位内切酶I-SceI切除pYLVS载体骨架,构建奶牛多位点基因打靶载体BAC-TDN-GD,利用接头LS使之环化.BAC-TDN-GD打靶载体与pYLSV质粒组成了通用型奶牛多位点打靶载体系统.以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术,将部分解决目前存在的打靶效率低、安全性差等问题.     

奶牛胎儿细胞多位点基因打靶的研究

利用奶牛rDNA基因间的ITS重复序列作为靶位点,对奶牛胎儿成纤维细胞进行多位点基因打靶,建立以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术,并为克隆定点转基因奶牛提供核供体。首先分离培养出奶牛胎儿成纤维细胞,并进行性别鉴定和核型分析。采用MTT比色法确定了G418和GCV正负筛选的最低有效浓度。然后通过多位点基因打靶载体转染、正负筛选获得7个表达绿色荧光的克隆细胞系,经PCR,RT-PCR和测序证实其中1个细胞系为定点整合的克隆细胞系,且GFP基因表达。     

世界首例iPS克隆猪是这样诞生的

正世界上首次获得i PS(诱导多能干细胞,induced Pluripotent Stem Cel s)克隆猪,为基于i PS进行基因修饰大动物的制作打通了技术瓶颈;首次将锌指核酸酶介导的基因打靶技术应用于猪基因修饰,实现了对大动物高效基因打靶;首次将2A序列介导的多基因转移技术应用于猪基因组修饰,成功获得了四色荧光猪,并实现了多个外源基因在动物体     

揭示基因组功能的强大工具:基因打靶技术——2007年度诺贝尔生理学或医学奖成果简介

基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞(ES细胞)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段,具有定位性强、打靶后新的基因有随染色体DNA稳定遗传的特点,其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等,相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获技术等,为生命科学、基因组学和疾病治疗等领域的研究提供了强大的工具。美国科学家Mario R. Capecchi,Oliver Smithies和英国科学家Martin J. Evans因基因打靶技术的开创性研究而获得了2007年度诺贝尔生理学或医学奖。     

中国自主研发的各类实验动物模型

正中国科学院南京大学-南京生物医药研究院和广州生物医药与健康研究院、广州医药研究总院等合作利用CRISPR/Cas9技术成功培育的两只肌肉生长抑制素(MSTN)基因敲除狗的研究成果,这是在世界上首次建立了狗的基因打靶技术体系。     

Progress of gene targeting in mouse

Gene targeting is a powerful approach of studying the gene function in vivo. Specific genetic modifications, including simple gene disruption, point mutations, large chromosomal deletions and rearrangements, targeted incorporation of foreign genes, could be introduced into the mouse genome by gene targeting. Recent studies make it possible to do the gene targeting with temporal and spatial control.     

Gene targeting in normal and amplified cell lines

Targeted recombination in mammalian cells is rare compared with non-homologous integration. In Saccharomyces cerevisiae the reverse is true. Differences in targeting efficiency could arise because a target of unique DNA is 200 times more dilute in mammalian genomes than it is in yeast. We tested this possibility by measuring gene targeting in normal CHO cells with two copies of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene and in amplified CHOC 400 cells, which carry 800 copies. If the concentration of the target gene is critical, amplified cells should show an enhanced frequency of targeted recombination relative to non-homologous integration. Using a positive/negative selection protocol, we demonstrated that the efficiency of targeting into DHFR genes is indistinguishable in normal and amplified CHO cells. As targeting does not depend on the number of targets, the search for homology is not a rate-limiting step in the mammalian pathway of gene targeting. Thus, the difference in genome size is not the basis for the different outcomes of targeting experiments in S. cerevisiae and mammals.     

高效率基因打靶载体的构建及受体成肌细胞的制备

通过建立高效率“双无”（无启动子、 无polyA）打靶载体MSTN-GFP和MSTN neo及新生绵羊和胎儿成肌细胞的培养和鉴定, 优化了培养条件, 改善了细胞状态, 为提高打靶效率及体细胞克隆提供了稳定的核移植供体； 同时无启动子打靶载体的构建也有利于打靶后阳性细胞克隆的分子鉴定.     

人眼检测的混合加权特征方法

基于眼动跟踪的目视瞄准技术可使无人武器的目标跟踪瞄准操控摆脱对肢体的需求,是未来无人武器的重要操控方式.提出一种混合加权特征方法,通过Gabor算子滤波、计算积分图、引入局部区域方差作为权重对混合特征编码进行加权运算并与级联分类器训练结合,获得人眼区域检测.试验结果表明,本文方法优于常用的Haar-like、LDP方法,并且随着级数的增加误检率呈下降趋势.该方法可提高人眼检测率、降低误检率,为满足无人武器目视瞄准对实时性和准确率的要求提供可能的技术途径.      

基因治疗临床应用的研究进展

基因治疗作为一种新型的疾病治疗手段,正在广泛用于多种疾病的治疗领域.简单介绍了基因治疗的基本途径和临床应用.