人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因在烟草中共表达对棉铃虫有更好的杀虫活性

利用叶盘转化法获得了携带Cry1Ac, Cry1Ie和同时携带这两个基因的3种类型转基因烟草. 利用ELISA法测定转基因烟草叶片中Bt蛋白含量, 在携带两种Bt基因的转基因烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白分别占总蛋白的0.173%和0.131%. 在携带单个基因的烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白的含量分别为0.182% 和0.124%. 分别用野生型棉铃虫(Helicoverpa armigera)和Cry1Ac抗性棉铃虫的初孵幼虫在这3种类型的转基因烟草叶片上进行虫试, 并以未转基因烟草为负对照. 实验结果表明, 携带Cry1Ie基因的转基因烟草对这两种棉铃虫都有杀虫活性, 而携带Cry1Ac基因的转基因烟草仅对野生型棉铃虫有抗性, 携带两种Bt基因的烟草比仅含其中一个基因的烟草对这两种棉铃虫均有更好的杀虫效果. 该结果表明, 这两种Bt基因在转基因烟草中能够协同作用, 提高了烟草对害虫的杀虫效果. 同时, 转入两个Bt杀虫基因有可能成为延缓农业害虫对转基因作物产生抗性的新途径.     

转Bt 基因抗虫棉品种的推广利用与棉铃虫抗性的治理

我国现有３类转Ｂｔ基因抗虫棉种质材料：９４－２４,中心９４和Ｒ１９,它地棉铃虫初孵幼虫都表现出显著的抗虫性,用它们作亲本材料都已培育出转基因抗虫棉的品种或杂交种,这三类抗虫棉在不同生育期抗虫性表现程度不同,苗期（１０片主茎叶以下）吉处发孵死亡率一般达１００％,生育后期抗虫性则有所下降,Ｂｔ基因转发方棉花后能稳定遗传给后代,不同世代的抗虫性表现基本一致,通过室内汰选,烟芽夜蛾等害虫很容易对Ｂｔ杀虫     

Bt杀虫基因在转基因双价抗虫棉中的整合与遗传稳定性

Bt抗虫棉中Bt杀虫基因的表达与遗传稳定性对抗虫棉的品种培育和商品化生产至关重要,利用转基因双价抗虫棉R3,R4及R5材料基因组DNA,然后采用GFMCryIA基因的PstI酶切片段做探针,进行Southern杂交分析,研究Bt杀虫基因在双抗抗虫棉虫棉所19材料基因中的整合、拷贝数及遗传稳定性,结果表明,转基因抗虫棉和阳性对照经HindⅢ酶切,Southernblot均出现了约4．7kb的杀虫基因阳性带,从而在分子水平上证实了杀虫基因在棉花基因组中的整合及其完整性,利用在杀早基因中只有一个酶切位点的XhoI酶切后,阳性对照出现了预期大小的17．7kb的阳性带,而双价转基因抗虫棉R3,R4及R5材料均出现了分别为约17．7,8．0,5．5和4．7kb的4条阳性带,初步认为,外源Bt杀虫基因在双价抗虫棉中棉所19材料基因组中至少有4个拷贝,这4个拷贝中很可能有一个以上能够稳定遗传和表达,该研究结果为以后的双价抗虫棉品种培育及商品化生产提供了依据。     

其他寄主作物能成为Bt感性棉铃虫的庇护所吗?

害虫的抗药性是苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)微生物杀虫剂及转Bt基因抗虫作物在推广应用过程中潜在的巨大生态风险,建立庇护所、提供敏感种群是美国、澳大利亚等地在转Bt基因抗虫棉种植过程中采取的主要的抗性防治措施;而国内转Bt基因抗虫棉在田间多与其他作物套种,没有建立专门的庇护所。应用PCR指纹谱方法,检测了棉铃虫不同寄主种群的遗传差异,分析了棉铃虫不同寄主植物种群间的基因交流情况。结果表明,在田间棉铃虫的不同寄主种群中,Bt棉种群与普通棉花、玉米、蓖麻种群间基因交流频繁,而与芝麻、花生种群间交流存在一定障碍,彼此个体间不能进行随机交配,说明除普通棉花外、玉米、蓖麻能作为庇护所,防止棉铃虫对转Bt抗虫棉的抗性、而芝麻和花生不适于作为庇护所在田间与转基因棉花套种。     

利用ubi1内含子增强Bt cry1Ah基因在转基因玉米中的表达

Bt cry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌分离株BT8中鉴定克隆的新型杀虫蛋白基因. 本研究构建了两个含有Bt cry1Ah基因的植物表达载体, 在其中一个植物表达载体(pUUOAH)的玉米Ubiquitin启动子与cry1Ah基因之间插入了玉米泛素蛋白基因ubiqutin1的第一个内含子(ubi1). 利用基因枪法将其导入玉米(Zea mays L.)胚性愈伤组织中, 得到了可育的再生植株. PCR及Southern blot检测结果表明, cry1Ah基因已整合入玉米基因组中, 并稳定遗传至下一代. 对T₁及T₂代转基因植株进行ELISA检测, 发现pUUOAH载体转基因植株Cry1Ah蛋白的平均表达量提高了20%. 对T₂代转基因植株进行了田间抗虫性鉴定, 发现转cry1Ah基因玉米对玉米螟有很高的抗性, 并且pUUOAH载体转基因植株的抗虫性好于pUOAH(无内含子)载体的转基因植株. 以上结果表明, 玉米ubi1内含子可以有效增强cry1Ah在转基因玉米中的表达.     

三种夜蛾科昆虫对烟草烟碱的诱导及其与昆虫下唇腺葡萄糖氧化酶的关系

烟草Nicotiana tabacum L.是棉铃虫Helicovepa armigera (Hübner)、烟青虫Helicoverpa assulta (Guenėe)和斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera, Noctuidae)的共同寄主. 用HPLC测定烟草叶片烟碱含量, 比较了3种昆虫取食以及机械损伤模拟取食对烟草诱导防御反应的差异. 结果表明, 棉铃虫、烟青虫取食以及机械损伤后用它们的下唇腺提取液处理烟草叶片, 都能够抑制损伤对烟草烟碱的诱导; 在烟草叶片的机械损伤部位涂抹黑曲霉Aspergillus niger葡萄糖氧化酶也能够抑制损伤对烟草烟碱的诱导. 相反, 斜纹夜蛾取食或机械损伤后用该幼虫下唇腺提取液处理烟草叶片, 都能够促进损伤对烟草烟碱的诱导; 而加热变性后的斜纹夜蛾下唇腺提取液同样能够促进机械损伤对烟草烟碱的诱导. 由此可见, 昆虫下唇腺中的物质对烟草烟碱的诱导反应有着重要作用. 进一步检测发现, 棉铃虫和烟青虫下唇腺中都存在葡萄糖氧化酶活性, 且棉铃虫下唇腺中该酶的活性显著高于烟青虫的, 而在斜纹夜蛾下唇腺提取液中没有检测到该酶活性; 葡萄糖氧化酶在棉铃虫中主要存在于下唇腺, 其最适pH为7.0, D-葡萄糖是它的最适底物; 在幼虫发育期内, 棉铃虫下唇腺中葡萄糖氧化酶的活性是动态变化的, 在每一龄期幼虫取食最活跃的时期该酶的活性也最高.     

多角体完整重组病毒的构建及苏芸金杆菌截短δ内毒素基因的表达

杆状病毒由于其特异的宿主专一性,对有益昆虫、人畜无害和具有持续性和流行性等优点而广泛用于生物防治.但其主要缺点是毒力不高,杀虫速度慢,限制了它的应用.曾有人分别克隆苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)全长δ内毒素cryIA(c),cryIA(b)基因到杆状病毒多角体蛋白基因ocu(occlusion)启动子下游构建重组病毒,但并没有提高杀虫速度.其原因可能是昆虫细胞内缺少碱性条件,不能降解全长毒素基因表达的原毒素有活性的毒性片段.在转基因植物中,3′半端截短的cryIA(b)基因的表达量比全长基因高10倍,并且只有截     

食物中Ni~(2 )胁迫对斜纹夜蛾幼虫中肠细胞解毒酶的影响

食物中的Ni2 可在斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius幼虫中肠细胞中积累,并能诱导中肠细胞中解毒蛋白金属硫蛋白(metallothionein,MT)的表达.本文研究了食物中不同剂量Ni2 对S.litura5龄和6龄幼虫中肠细胞解毒酶羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)和谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性的影响.结果表明,S.litura幼虫连续3代取食含不同剂量Ni2 的食物后,5龄幼虫中肠细胞内的CarE活性均在低剂量Ni2 (≤5mg/kg)胁迫下低于对照,在高剂量Ni2 (≥10mg/kg)胁迫下高于对照.第1代6龄幼虫中肠细胞内的CarE活性也表现为低剂量Ni2 胁迫抑制而高剂量Ni2 胁迫增加的趋势,但第2和第3代6龄幼虫中肠细胞内的CarE活性均低于对照.连续3代受不同剂量Ni2 胁迫的5龄和6龄幼虫中肠细胞的GST活性均高于对照,并随饲料中Ni2 剂量(1～20mg/kg)的增加而增加。     

食物中Ni2+胁迫对斜纹夜蛾幼虫中肠细胞解毒酶的影响

食物中的Ni²⁺可在斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius幼虫中肠细胞中积累, 并能诱导中肠细胞中解毒蛋白金属硫蛋白(metallothionein, MT)的表达. 本文研究了食物中不同剂量Ni²⁺对S. litura 5龄和6龄幼虫中肠细胞解毒酶羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase, GST)活性的影响. 结果表明, S. litura幼虫连续3代取食含不同剂量Ni²⁺的食物后, 5龄幼虫中肠细胞内的CarE活性均在低剂量Ni²⁺(≤5 mg/kg)胁迫下低于对照, 在高剂量Ni²⁺(≥10 mg/kg)胁迫下高于对照. 第1代6龄幼虫中肠细胞内的CarE活性也表现为低剂量Ni²⁺胁迫抑制而高剂量Ni²⁺胁迫增加的趋势, 但第2和第3代6龄幼虫中肠细胞内的CarE活性均低于对照. 连续3代受不同剂量Ni²⁺胁迫的5龄和6龄幼虫中肠细胞的GST活性均高于对照, 并随饲料中Ni²⁺剂量(1~20 mg/kg)的增加而增加.     

表达cryIA/gna双价抗虫基因烟草兼抗棉铃虫和蚜虫

利用人工合成的、密码子优化后的雪花莲凝集素（ＧＮＡ）基因,与人工合成的ＣＦＭ ｃｒｙＩＡ构建了双价抗虫基因植物高效表达载体。通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得２８株卡那酶素抗性植株,经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹检测,证实了双价抗虫基因在烟草基因组中的整合,转基因烟草杀棉铃虫试验表明,４０％转基因烟草植株对棉铃虫具有高抗性;Ｂｔ杀虫蛋白ＥＬＩＳＡ检测获得与虫试较一致结果,抗虫性较强株Ｋ１１号ＣｒｙＩ     

重金属Ni2+连续胁迫导致其在斜纹夜蛾体内积累并降低存活率

在人工饲料中添加不同浓度的Ni²⁺, 采用等离子体原子发射光谱仪检测Ni²⁺在连续3个世代植食性昆虫斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius六龄幼虫、蛹和成虫体内的积累, 并通过单头饲养评价了Ni²⁺积累对不同世代斜纹夜蛾幼虫存活率、化蛹率与成虫羽化率的影响. 结果表明, Ni²⁺可在六龄幼虫、蛹和雌雄成虫体内积累, 积累量随幼虫胁迫世代数的增加而增加; 同时也随幼虫饲料中Ni²⁺浓度的增加而增加, 并表现出显著的剂量-反应关系. 变态后, 蛹和成虫体内的Ni²⁺显著低于幼虫体内的Ni²⁺浓度, 过量的Ni²⁺可随化蛹所蜕皮排出体外. 同时, 不同世代斜纹夜蛾幼虫存活率、化蛹率与成虫羽化率均随Ni²⁺胁迫浓度的增加而降低.     

利用RNA干扰技术改良植物对昆虫的抗性

棉毒素(棉酚)是广泛存在于棉花中的植物次生代谢化合物,它在植物对外界的防御反应中起重要作用,对大多数包括植食性昆虫在内的生物体具有普遍毒性。然而,棉铃虫(Helicoverpa armigera)却能以棉花为食完成生活史,这说明棉铃虫对棉酚存在一定的耐受性。我们以棉花和棉铃虫为研究对象,分离了棉铃虫参与棉毒素解毒的P450基因(CYP6AE14)。CYP6AE14在棉铃虫肠中高表达,能专一地被棉酚诱导。当食物中存在棉酚的情况下,GIP的表达水平与棉铃虫的生长呈正相关。经过生物技术改造,获得了含CYP6AE14相应序列的dsRNA转基因植物。当棉铃虫进食这种转基因植物后,棉铃虫P450基因的表达显著降低,对棉酚的耐受性大大减弱,用棉花叶片喂食时这些棉铃虫时,     

两种植物病毒编码蛋白的基因沉默抑制子功能鉴定

采用农杆菌浸润方法以及重组的马铃薯X病毒(PVX)表达载体, 研究了甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)编码的P14蛋白和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)编码的S6蛋白对植物基因沉默的抑制作用. 绿色荧光蛋白(GFP)表型观察及核酸杂交结果表明, 这2种病毒基因均能够强烈抑制转基因本生烟(16C)中由同源序列引起的gfp基因沉默, gfp基因mRNA的含量明显高于未发生沉默抑制的对照植株, 并导致PVX感染后的寄主症状加重, 说明它们可能是由病毒编码的RNA沉默抑制因子. 其中, RBSDV S6基因对植株体内基因组DNA甲基化过程的抑制作用更为强烈.     

Ni2+在斜纹夜蛾幼虫中肠的积累并诱导金属硫蛋白表达

通过在人工饲料中添加不同浓度的Ni²⁺, 采用等离子体原子发射光谱仪明确了Ni²⁺在连续3个世代植食性昆虫斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius 6龄幼虫中肠内的积累, 并通过镉血红蛋白饱和法检测了连续3个世代5, 6龄幼虫中肠细胞内的金属硫蛋白含量在120 h内的变化情况. 结果表明, Ni²⁺可在6龄幼虫中肠细胞内积累, 积累量随幼虫胁迫世代数以及幼虫饲料中Ni²⁺浓度的增加而增加, 并表现出显著的剂量-反应关系. 同时, S. litura幼虫中肠细胞中积累的Ni²⁺能诱导中肠细胞中金属硫蛋白的表达, 表达量随中肠中Ni2+量的增加而增加, 并随着胁迫时间的延长而提高, 并存在一定的阶段特异性.     

Ni2+胁迫对斜纹夜蛾幼虫血细胞凋亡的影响

通过在人工饲料中添加不同浓度的Ni²⁺, 采用流式细胞技术和激光扫描共聚焦显微镜, 分析了Ni²⁺胁迫对连续3个世代植食性昆虫斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabriciurs幼虫血细胞凋亡的影响. 结果表明, 在Ni²⁺胁迫下, 第1代斜纹夜蛾幼虫血细胞的凋亡率随饲料中Ni²⁺浓度的增加而增加, 最高Ni²⁺浓度(40 mg/kg)胁迫下的血细胞凋亡率显著高于其他处理中的凋亡率. 第2代, 受5 mg/kg Ni²⁺胁迫幼虫的血细胞凋亡率最高, 高浓度Ni²⁺胁迫下的血细胞凋亡率呈下降趋势. 第3代斜纹夜蛾幼虫血细胞的凋亡规律类似于第2代, 但高浓度胁迫下的血细胞凋亡率都受到显著抑制. 因此, Ni²⁺胁迫对斜纹夜蛾幼虫血细胞凋亡的影响与饲料中Ni2+的浓度和胁迫的世代数相关.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

棉铃虫促前胸腺激素的表达模式与发育调节

利用免疫组织化学检测和酶联免疫吸附分析分别对滞育和非滞育类型的棉铃虫促前胸腺激素(prothoracicotropic hormone, PTTH)的合成与分泌模式进行了研究. 免疫组织化学结果表明, 定位在棉铃虫脑前背侧的两对PTTH神经分泌细胞在滞育和非滞育六龄幼虫末期有相似的阳性反应细胞; 在蛹期阶段, 滞育和非滞育类型个体在化蛹后4 d开始出现明显的不同. 酶联免疫吸附分析测定了从六龄幼虫到蛹末期血淋巴中的PTTH滴度变化, 滞育和非滞育类型的变化趋势在幼虫阶段相似, 蛹期则表现出明显的不同, 提示PTTH的表达对调节棉铃虫蛹滞育起到关键作用.     

转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶

人溶菌酶是由130个氨基酸组成的碱性多肽, 具有抗菌、抗病毒和增强免疫力的功能, 对生物体的自身防御起着重要作用. 为研究乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶和提高牛奶的免疫活性, 制备了以溶菌酶基因组序列为目标基因的表达载体的转基因小鼠模型. 经转基因小鼠的制备, 通过PCR和Southern blot 检测, 从83只出生小鼠中获得6只整合人溶菌酶融合基因的转基因小鼠. 对F1代小鼠的PCR检测表明外源基因可以遗传给后代. 在3只转基因阳性母鼠的乳汁中, 用Western blot方法可以检测到重组人溶菌酶的存在, 最高表达量达到0.2 mg/mL. 经活性检测, 转基因小鼠乳清的溶菌酶活性显著提高, 已达到人乳清溶菌酶活性的0.4倍, 而非转基因小鼠乳清具有极低的溶菌酶活性. 尽管转基因小鼠乳清中重组人溶菌酶活性还低于人乳清中溶菌酶活性, 但是转基因小鼠乳汁中的重组人溶菌酶与人溶菌酶具有相同的比活力. 为乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶的研究和开发应用打下了坚实的基础.     

根癌农杆菌介导的CryⅠA(b)基因在哈茨木霉菌中的转化

根癌农杆菌介导的遗传转化是植物基因工程中常规方法, 利用这一转化方法, 将CryⅠA(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中, 转化率约为60～180个转化子/106个孢子. 通过对转化子的RT-PCR检测和Southern 杂交分析表明, CryⅠA(b)基因已整合进哈茨木霉菌基因组中, 而且在转录水平上得到表达. 转化子都能够稳定遗传. 对转化子抑菌活性和杀虫活性测定表明, 转化子不但保持了原菌株良好的抑菌活性, 而且表现出一定的杀虫效果. 兼有杀虫防病双重作用的基因工程哈茨木霉菌的构建显示了生物技术在生防真菌遗传改良中的应用潜力.     

棉铃虫(Heliothis armigera Hübn)血球细胞单层培养

近年来,昆虫病毒在组织培养中的感染和增殖的研究,已有很大的进展。本文报道棉铃虫血球细胞的单层培养方法及结果,为研究昆虫病毒与宿主细胞间的相互关系,提供技术手段。Hink和Ignoffo曾建立美洲棉铃虫(Heliothis Zea)成虫卵巢的细胞系。但棉铃虫(H.armigera)幼虫血球细胞的单层培养,还未见有报道。自1978年4月以来,棉铃虫血球细胞的体外培养先后进行了二十余次,获得成功。材料大多数是用人工饲料单管饲养的5龄左右的健康幼虫,饥饿24小时后,用自来水洗净虫体,进