稳定表达TFEB-GFP细胞系的构建及促TFEB入核药物筛选

本研究旨在构建稳定表达TFEB-GFP的HeLa细胞系,并利用其筛选促进转录因子EB(TFEB)入核药物.利用分子生物学技术成功构建了重组表达载体pLVX-AcGFP1-N1-TFEB,并进行慢病毒包装,进而侵染HeLa细胞,通过嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株.采用荧光显微镜技术及免疫印迹技术(Western blot)证实稳定表达TFEB-GFP细胞株构建成功.利用该细胞模型筛选得到促TFEB入核药物盐酸舍曲林(Sertraline HCl),此药物能够促进转录因子TFEB靶基因的表达,并促进细胞自噬.MTT实验表明Sertraline HCl抑制肿瘤细胞活力,其对肿瘤细胞的杀伤作用可能是通过其激活自噬引起的.     

CXCR7对HeLa细胞增殖、粘附和侵袭能力的影响

基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在肿瘤侵袭、转移过程中起着重要的调控作用.此前认为SDF-1是通过其唯一受体CXCR4来起作用.近年来发现SDF-1还有另一作用受体——CXCR7,SDF-1/CXCR7在部分肿瘤侵袭转移过程中起重要作用,但其在宫颈癌HeLa细胞中的作用目前尚未明确.通过Western blotting检测HeLa细胞中CXCR4和CXCR7的表达,阻断CXCR4或CXCR7后,通过MTT法评价细胞增殖能力,细胞粘附实验评价细胞粘附能力,Transwell实验评价细胞侵袭能力.结果表明,CXCR4和CXCR7在HeLa细胞中表达.阻断CXCR4或CXCR7后,SDF-1诱导的HeLa细胞增殖、侵袭和与内皮细胞的粘附能力均被阻断.结果提示CXCR7在SDF-1诱导HeLa细胞增殖、侵袭和与内皮细胞的粘附过程中起着重要作用,将有望成为治疗宫颈癌转移的新靶点.     

H13诱导人卵巢癌A2780细胞凋亡及其机制的研究

探讨新型Topo I抑制剂H13对人卵巢癌A2780的杀伤和诱导凋亡的作用机制.MTT法对人卵巢癌A2780的杀伤作用;流式细胞仪研究H13对A2780细胞的凋亡诱导作用;Western Blot法检测H13对A2780细胞内caspase-3和p53蛋白表达的影响.H13对人卵巢癌A2780有明显细胞毒性作用,并且有剂量依赖性;A2780细胞在H13作用后出现特征性凋亡形态特征,且凋亡率由5.7%上升为20.6%;H13明显增加p53蛋白的表达和caspase-3蛋白的表达.H13对人卵巢癌A2780有明显的杀伤和促凋亡作用,其机制可能依赖于细胞内p53蛋白和caspase-3蛋白表达增高.     

人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建

目的:为研究细胞周期蛋白在肿瘤形成过程的分子机制,构建带FLAG标签的细胞周期蛋白E的真核表达载体,并检测其在瞬时转染HeLa细胞株中的蛋白表达。方法:通过RT-PCR扩增cyclinE基因编码cDNA,并将扩增的cDNA片段插入p3XFLAG-CMVTM-14真核表达载体,重组子经酶切分析和测序鉴定后,用脂质体介导的基因瞬时转染法,将重组正确的表达载体转染HeLa细胞,用Western-blot技术检测其在HeLa细胞中融合蛋白的表达。结果:经酶切鉴定和测序分析证实人cyclin E的真核表达载体构建成功,并能在瞬时转染的HeLa细胞中表达。结论:成功构建了人cyclin E的真核表达载体,为进一步研究细胞周期蛋白的功能奠定了基础。     

人白细胞介素32的真核表达、纯化及生物学活性鉴定

摘要:目的：构建人白细胞介素32（IL-32）和IgG4基因Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO/DG44）克隆,并检测重组蛋白的表达及相应的生物学功能.方法：采用聚合酶链反应(PCR)从LPS激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32基因,并克隆到构建IL-32融合基因的真核表达载体 IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC.经脂质体法转染CHO/DG44 细胞, 通过RT-PCR检测,筛选出实验组细胞,并对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤（MTX）加压筛选,利用ProteinG-Agarose亲和纯化培养上清中表达的融合蛋白,并通过SDS-PAGE、免疫印迹鉴定检测目的蛋白的表达,最后以 HeLa细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性.结果：构建了一个IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC;筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆; 亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白在SDS-PAGE电泳后与预期分子质量大小相符,能够与羊抗人IgG-HRP 抗体特异结合,并能促进HeLa细胞的死亡.结论：成功构建了人IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆.     

两种重组融合蛋白的分子生物学特性比较

使用DNASTAR软件,利用计算机模拟比较了带有亲和标记和连接肽的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH与DAB389-αMSH两种融合蛋白的抗原性、亲水性、等电点及表位等分子生物学特性.结果显示,DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的抗原性和表位明显低于DAB389-αMSH,而DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的亲水性高于DAB389-αMSH,两者的等电点均为5.9.     

构建重组人CatSperl特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-590)原核表达载体并表达重组抗原.方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体.测序鉴定后转化工程菌株E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白.用TricineSDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况.结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白.Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原.结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsperl特异抗原.     

表达肿瘤抗原HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性宫颈癌细胞模型的构建和鉴定

为建立内源性表达58型人乳头瘤病毒(Huamn papillomavirus type 58,HPV-58)重要癌抗原E7蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型.以HPV-58全基因组为模板,采用PCR法扩增E7蛋白的编码基因,构建真核表达载体pEGFP-N2-HPV58E7;转化大肠杆菌DH5α,通过DNA测序鉴定质粒载体;经除内毒素纯化后,将大量制备的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用RT-PCR和细胞免疫荧光方法研究重组质粒在人源细胞中的表达情况;最后,选择HPV检出阴性的HLA-A*0201阳性人宫颈癌C33A细胞株为宿主细胞,采用脂质体转染、G418抗性加压筛选和细胞克隆化培养技术,建立能够稳定表达HPV-58 E7的恒定转染细胞株.采用RT-PCR、Western-blot和细胞增殖测定等方法从转录、翻译和表型等3个层次对所建细胞株进行鉴定研究.研究结果显示:克隆制备了HPV-58 E7蛋白的编码基因;构建获得了能够在人源细胞中表达HPV58E7-EGFP融合蛋白的真核表达质粒;并成功建立了能够稳定表达HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型;核酸和蛋白水平的鉴定结果表明所建模型细胞能够表达HPV-58 E7癌抗原,宿主细胞本身表达的Ⅰ类组织相容性抗原HLA-A*0201有望通过内源性抗原加工途径将E7抗原的细胞毒性T细胞(Cytotoxic lyphocyte,CTL)表位提呈到细胞表面;另外,细胞增殖试验结果亦表明该细胞模型体现出E7蛋白显著的诱导细胞增殖的生物学特征.总之,能够稳定表达HPV-58 E7癌蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型的建立为后续即将展开的以HPV-58 E7为靶标的宫颈癌治疗性疫苗和药物的寻找和研究奠定基础.     

视黄醇X受体小分子配体衍生物对宫颈癌细胞周期及细胞凋亡的影响

为筛选视黄醇X受体α(RXRα)配体XS-23的衍生物中作用于细胞周期的化合物,通过蛋白免疫印迹检测细胞周期G0/G1期检查点关键负调控因子p21 WAF1/CIP1(简称p21)、细胞M期周期蛋白Cyclin B1的表达水平,从中筛选到两个编号分别为05和06的化合物,可导致人宫颈癌HeLa细胞中p21表达上调和Cyclin B1表达下调.用流式细胞术和siRNA干扰技术检测化合物对细胞周期的影响及其RXRα依赖性,结果显示:化合物05和06可引起G0/G1期细胞比例显著增加,同时G2/M期细胞比例显著下降,且化合物05和06引起p21表达水平上调的作用在一定程度上依赖于RXRα.用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡率,同时检测聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)切割蛋白水平及其RXRα依赖性,结果表明:化合物05和06均能够引起HeLa细胞凋亡率显著增加,并导致PARP切割且具有一定的RXRα依赖性.进而用计算机模拟的方法对化合物与RXRα进行分子对接,模拟化合物与RXRα可能的结合位点,结果显示化合物05和06可能与RXRα蛋白的helix12、helix3、helix4形成的表面区域结合.综上,筛选出的化合物05和06可能通过与RXRα表面结合,阻滞HeLa细胞周期于G0/G1期,最终诱导HeLa细胞凋亡.     

云芝子实体多糖对人宫颈癌HeLa细胞生长和凋亡的影响研究

研究云芝多糖(Coriolus versicolor polysaccharides,CVP)对宫颈癌HeLa细胞系生长和凋亡的影响及可能的通路。采用MTT方法测定了CVP对HeLa细胞体外生长抑制的作用,结果表明当CVP浓度在0~0.625μg/mL的范围内,随着CVP浓度的增加,HeLa细胞的存活率逐渐减少.流式细胞仪检测凋亡细胞的结果显示,使用0.5μg/mL CVP处理HeLa细胞,作用24h和48h后细胞凋亡率分别为26.36%和63.81%;实时荧光定量PCR检测结果显示CVP处理细胞后Bcl-2基因的表达量显著下降(P0.05).该研究证明CVP能抑制HeLa细胞的生长、诱导细胞的凋亡,其作用机制与影响Bcl-2基因的表达下调有关.     

东亚马氏钳蝎部分纯化的神经毒素对GH3细胞钠电流的影响

马氏钳蝎粗毒ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离后可得到几个组分。其中峰Ⅱ毒素对蜚蠊毒性较大，而峰Ⅲ毒素对小白鼠毒性较大，可以认为它们是部分纯化的昆虫类毒素和哺乳类毒素。     

小麦赤霉病毒素研究进展

小麦赤霉病是小麦生产中的重要病害之一,可造成小麦产量的损失和严重的毒素污染.关于小麦赤霉病菌产生的毒素,国内外已有大量研究.本文主要以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)为主,对镰刀菌毒素的污染情况、在小麦赤霉病发生过程中的作用、生物合成、毒理学作用、检测方法及其分子生物学研究进展作一总结.     

高效液相色谱对玉米大斑病菌毒素的分离与制备

建立了以高效液相色谱分离制备玉米大斑病菌2号小种毒素的方法,研究了以Nova-PakC18分析柱、制备柱对检测波长、流动相、pH值对分离和制备的影响.结果表明5-羟甲基-2-呋喃甲醛的检测限为0.017 mg/L,其他组分的相对偏差为0.09%～1.9%.在0.005～0.10 g/L范围内,标准毒素的线性回归良好,相关系数和回收率分别为0.971 3和98.2%.该方法快速、准确且重现性好,适于毒素的分离制备.     

亚历山大藻细胞周期中毒素含量及组成的变化

用细胞同步化培养的方法,研究了塔玛亚历山大藻A.tamarenseCI01株不同细胞周期细胞中毒素含量与组成的变化.结果表明,A.tamarenseCI01细胞分裂主要发生在早上6时至8时,细胞密度在6 h内增加近一倍.细胞内毒素合成主要在细胞周期的G1期,由光诱导合成,毒素含量（fmol/cell,Qt）在光周期前8 h内从17 fmol/cell增加到分裂前的24 fmol/cell,而在其它细胞周期细胞内毒素含量稳定,基本不合成毒素.比较分析单细胞C1,2毒素和GTX2,3毒素合成时间及速率,推测在A.tamarenseCI01中细胞首先合成GTX2,3,在其它修饰酶的作用下再转化为C1,2.     

映山红对山羊的毒性研究

每天按５．０ｇ／ｋｇ体重或０．０１８６ｇ／ｋｇ体重给山羊灌服映山红枝叶或其毒素粗提物，连续２～３天均可引起急性中毒和死亡，中毒山羊的主要临床症状有剧烈呕吐，流涎，食欲废绝，便秘，呼吸困难，肌肉无力，心率先减慢而后心动过速；心电图显示初期窦性心动过缓，室性期前收缩，随后发生心房纤颤和心动过速；临床病理学检查表明，血液红细胞数、血红蛋白含量、红细胞压积、血清谷丙转氨酶、血清谷草转氨酶和血清乳酸脱氢酶活性，均有不同程度升高；病理学检查发现大脑、小脑、脊髓、心、肝、肾、肾上腺和小肠淤血、出血、变性甚至坏死，肺淤血和水肿，以及大脑、肝、肾上腺等器官的小静脉和血窦中形成微血栓。应用阿托品、活性炭、补充水和电解质对映山红中毒的山羊有一定治疗效果。     

A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛、脸肌痉挛68例报告

目的：探讨A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛和睑肌痉挛的效果,方法：应用A型肉毒杆菌毒素局部肌肉注射治疗共68例,药物浓度为0．1－0．2ng/mL(25-50U/mL),结果：有效率为100％,其中完全缓解85．3％,明显缓解及部分缓解14．7％,显效时间4h-3d,作用持续时间12－30周,无过敏和全身中毒反应,局部副作用轻微,可逆,结论：A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛和脸肌痉挛安全,简便,有效,可作为治疗面肌痉挛和睑肌痉挛的首选药物。     

施钙处理对大豆铝毒缓解作用的研究

采用水培法,以抗铝毒大豆品种浙春2号、对铝毒敏感大豆品种浙春3号为研究材料,设置不同的铝．处理水平（0、50、150mg·L^-1）和钙处理水平（0、80、160、320mg·L^-1）,研究了不同质量浓度的钙处理对大豆铝毒的缓解作用．结果表明：在铝胁迫下,增加钙的供应可减轻铝对植物的毒害,显著削弱铝毒导致的植株生物量、根系活力、可溶性糖和可溶性蛋白质含量及过氧化物酶（POD）活性的下降,以及游离脯氨酸含量的上升,有效提高植株对铝胁迫的抗逆性．低水平的钙（80mg·L^-1）对低水平的铝处理有较为显著的缓解作用,高水平的铝处理则需高水平的钙（320mg·L^-1）才能达到较显著的缓解作用．2个大豆品种比较而言,钙对浙春2号的铝中毒具有更显著的缓解作用．     

链格孢菌粗毒素的提取方法和稳定性的研究

以石油醚、乙酸乙酯、氯仿三种极性不同的溶济对501菌株的菌丝和培养液进行萃取，获取粗毒素，结果表明，501菌株产生的毒素是分泌培养液中的，是胞外毒素，且乙酸乙酯的萃取效果最好，回收率可达92．7％，萃取溶剂pH值对萃取结果没有影响。通过分析贮存时间、温度、pH对粗毒素稳定性的影响，表明贮存时间、温度、pH对毒素稳定性影响很小，有一定的开发价值。     

桑寄生毒蛋白的分离纯化与部分性质研究

中药桑寄生(Loranthas parasiticus Merr)中的毒蛋白(简称LPT)可以用DE—52离子交换层析和Sepbacryl—S—200分子筛过滤进行分离纯化.纯化的IPT进行还原及非还原SDS—PAGE,均呈现单一蛋白带且测得分子量为43,000d,表明LPT为一单链蛋白质.LPT对骨髓瘤细胞具有杀伤作用,其半致死量ID_(?)为1.O×10~(-7)mol/L.LPT对兔网织红细胞破碎中的蛋白质生物合成也具有抑作用,其半数抑制剂量为7.0×10~(-5)mo/L.