一种新的微管相关蛋白JWA对细胞内氨基酸平衡有重要调节作用

探讨了JWA蛋白在细胞内的确切定位、与微管蛋白的相互关系及对细胞内氨基酸平衡的调节作用. 应用4~37℃(微管解聚-聚合)交替作用法提取纯化大鼠脑组织中微管及其相关蛋白; 用免疫共沉淀法研究JWA蛋白与微管蛋白的相互作用; 应用基因转染和免疫荧光等实验方法研究低温(4℃)、秋水仙素(1 × 10^-5, 5 × 10^-5 mol/L)等处理的HBE细胞/ NIH3T3细胞中JWA和微管的动态变化及相互关系. 应用反义寡核苷酸技术结合氨基酸分析技术探讨JWA蛋白对PC12细胞内氨基酸平衡的调节作用. 结果表明, JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白, 与微管蛋白分布基本平行, 在绝大多数情况下伴随微管动力学改变(聚合或解聚)而同步发生变化, 并且可能参与了细胞有丝分裂的过程. JWA蛋白是细胞内氨基酸总量的一种重要负性调节蛋白, 并选择性地调节细胞内谷氨酸和牛磺酸含量.     

DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用

DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术, 自1994年提出以来, 经过了几十年的发展, 其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现. 腺相关病毒(adeno- associated virus, AAV)是一种细小病毒, 由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体. 但是AAV筛除存在一些不足, 如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展. 应用DNA 改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化, 有望解决这些问题. 本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用, 并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论.     

DNA改组在腺相关病毒定向进化中的发展及其应用

DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术,自1994年提出以来,经过了几十年的发展,其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现.腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)是一种细小病毒,由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体.但是AAV筛除存在一些不足,如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展.应用DNA改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化,有望解决这些问题.本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用,并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论.     

成熟登革病毒颗粒在中性培养条件下的冷冻电子显微镜三维重构

登革病毒(Dengue virus, DEN)为单股、正链RNA病毒, 属黄病毒科黄病毒属, 是依靠蚊子传播的虫媒病毒. 其基因组长约10.8 kb, 只有1个可读框, 编码3个结构蛋白(衣壳蛋白(C)、前膜蛋白(prM)和包膜蛋白(E))和7个非结构蛋白. 在内质网内膜组装DEN非成熟颗粒, 径长约60 nm, 囊膜由60个prM-E异二聚体形成的三聚体构成[1]. 在经过高尔基体的输运过程中, prM蛋白被剪切酶(furin)酶切为M蛋白, 包膜蛋白及其排列发生构象变化, 由90个E蛋白二聚体呈木排状平行于病毒表面紧密排列, 形成颗粒径长约50 nm的成熟颗粒[2]. ...........     

麻疹病毒RNA与寄主细胞质蛋白因子的相互作用

麻疹病毒(MV)属付粘病毒科,是单链的负链RNA病毒.基因组大小为16kb,其结构与同科的仙台病毒和弹状病毒科的水疱性口膜炎病毒(VSV)十分相似,然而基因转录与复制的机制可能不同.仙台病毒与VSV有效的体外转录系统早已建立,相似的系统在MV中却难以建立,而且与这两种病毒不同,在MV感染的细胞内至今未发现游离的前导链.研究表明,MV的体外转录仅在寄主细胞质蛋白提取物存在下才能进行,这意味着MV RNA的转     

SGK和14-3-3蛋白与TPO/MPL信号传导的丝氨酸/苏氨酸磷酸化机制有关

血小板生成素(thrombopoietin, TPO)是调节血小板生成最主要的细胞因子, 它的生物学效应由其受体c-Mpl介导. 用酵母双杂合系统(two-hybrid system)筛选了与c-Mpl膜内部分相互作用的蛋白质. 在5×106个转化子中, 得到48个阳性克隆. 测序结果表明, 其中一个是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SGK (serum and glucocorticoid-inducible kinase)的部分编码序列(编码第246位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区); 另一个为14-3-3 theta亚型蛋白的部分编码序列(编码第67位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区). 体外GST-Pulldown分析和免疫共沉淀进一步证实了c-Mpl与它们的相互作用. 通过系列缺失研究发现两个蛋白与c-Mpl相互作用的区域都在523~554 aa范围内. 用酵母双杂合系统进一步研究SGK和14-3-3蛋白之间的关系, 发现两者可能直接相互作用. SGK和14-3-3蛋白可能与TPO/MPL信号传导过程中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化有关.     

利用反向遗传学技术获得适应RK13细胞的兔出血症病毒

在前期构建的兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)全长cDNA分子的基础上, 利用SP6 RNA聚合酶系统, 在体外转录合成了病毒RNA. 用转染试剂将病毒RNA导入RK13细胞, 12 h后可见明显致细胞病变(CPE), 用间接免疫荧光方法在RK13细胞中检测到了病毒抗原的产生. 将收获的细胞培养物再次接种RK13细胞, 仍然能产生明显病变. 大量收取细胞培养物, 经差速离心法纯化病毒后, 在电子显微镜下可观察到RHD病毒粒子. 结果表明, 利用反向遗传学技术获得了可适应于RK13培养的RHDV, 为将来研究RHDV的分子致病机理和新型疫苗等提供了有利的工具.     

分选链接蛋白家族研究进展

分选链接蛋白(sorting nexins,SNXs)是一类含有吞噬细胞氧化酶同源性结构域(Phoxhomology domain,PX domain)蛋白的统称,在哺乳动物中有33个成员,其PX结构域易与定位于早期内涵体的磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate Ptd Ins(3)P)结合,参与蛋白跨膜过程中货物分子接头蛋白与膜锚定蛋白的结合等蛋白间的相互作用,故SNXs在细胞内吞、蛋白分选、细胞信号转导、膜运输、膜重塑和细胞器运动等方面均起重要作用.不同SNXs尚含差别较大的其他结构域,据差异结构域的不同,可进一步分为3大类.其中某些成员参与肿瘤、阿尔茨海默症、神经疾病和心脏病等人类重大疾病的发生.本文概述其发现、基因定位、结构、分类、功能及相关疾病等的研究现状,并展望其相关动向.     

JWA蛋白在细胞内与α-微管蛋白的共定位

探讨了JWA在细胞内的分布特征, 特别是在有丝分裂过程中的动态变化及与α-微管蛋白的关系. 用免疫共沉淀方法研究JWA与α-微管蛋白的相关性; 用基因转染技术研究JWA蛋白高表达后JWA蛋白和α-微管蛋白的相互关系; 用荧光显微镜技术研究低温处理、药物阻滞细胞周期、JWA反义寡核苷酸处理的PC12细胞JWA蛋白和α-微管蛋白的相互作用; 分别用流式细胞仪分析和激光共聚焦技术检测PC12细胞的各细胞周期蛋白在细胞内的分布. JWA作为一种新的微管相关蛋白, 在微管动力学变化过程和细胞周期不同阶段与α-微管蛋白分布平行, 可能对微管具有稳定作用.     

中国小麦花叶病毒RNA2外壳蛋白通读区及19 ku富半胱氨酸基因的克隆、表达及其编码蛋白定位

应用RT-PCR扩增中国小麦花叶病毒(CWMV)外壳蛋白通读区(readthrough, RT) 5′端(RTn)和3′端(RTc)及19 ku的富含半胱氨酸蛋白基因, 分别克隆并在E. Coli中表达, 表达蛋白粗提纯后免疫小鼠, 制备相应的抗血清和单克隆抗体. 用各种抗体检测小麦病叶汁液中RTn, RTc和19 ku蛋白. 结果表明, RTn和RTc分布在病叶细胞中的CWMV病毒粒子表面, 而19 ku蛋白则均匀分布于细胞质中.     

天花粉蛋白中第120～123位氨基酸区域在表现生物活性中的重要作用

天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是一种从葫芦科植物括楼根中提取的类型Ⅰ的致真核生物核糖体失活的蛋白.它在动物和人体中的作用具有对妊娠妇女的中期引产和抗人免疫缺失病毒(HIV)复制的生物活性.它的蛋白质的一级结构、空间构型和基因顺序均已阐明.通过对TCS氨基酸顺序的亲水性分析,得知其分子结构上分布着4个主要的亲水性区域,其中从第119～124位氨基酸这一区域又与其它2个从葫芦科植物中抽提出的单链RIP蛋白(即α-苦瓜蛋白(AMMC)和丝瓜蛋白(LUFA))具有高度的同源性,三者的同源率达89%.     

巴西固氮螺菌GlnB与NifA蛋白N端结构域的相互作用

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)可与多种重要作物联合固氮, 具有作为生物肥料的潜能. 固氮基因(nif)的转录激活蛋白NifA和PⅡ信号转导蛋白家族成员GlnB是参与该菌固氮调控的两个关键蛋白, 且NifA的活性调控依赖于GlnB. 研究结果表明, 在无氮条件下GlnB与NifA蛋白N端结构域存在相互作用, 且N端18和53位酪氨酸突变为苯丙氨酸的NifA与GlnB的互作增强. 研究还发现, NifA蛋白N端66~88位和165~176位氨基酸区域对于与GlnB蛋白的相互作用是必需的.     

表达EIAV Gag蛋白的DNA载体与重组痘苗病毒联合免疫效果的观察

将中国马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株的gag基因通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株的TK区, 经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVgag和rvv-LNgag. Western blot检测可知重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Gag蛋白. 使用本实验室构建的表达EIAV DLV和LN Gag蛋白的DNA载体单独或与表达相应蛋白的重组痘苗病毒联合免疫小鼠, 结果表明各免疫组小鼠体内均产生了针对EIAV的特异性体液和细胞免疫应答. 统计学分析显示, 联合免疫组与单独免疫组相比, 诱导的特异性结合抗体滴度无显著性变化, 而淋巴细胞增殖应答和CTL水平则显著增强, CTL杀伤率最高可达31%, DLV Gag蛋白与LN Gag蛋白诱导的免疫应答强度无显著性差异. 研究结果有助于阐明我国按照传统路线研制成功的EIAV弱毒疫苗的免疫机制, 并为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定基础.     

大麦黄矮病毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜体内传毒相关蛋白的确定

应用双向电泳和病毒覆盖测定技术, 从大麦黄矮病毒麦二叉蚜和麦长管蚜株系(GAV)的传毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜的蛋白质提取物中检测到一种分子量为50 kD的蛋白(P50), 它与提纯的病毒有高的亲和反应. 对麦二叉蚜体内的P50进行了电泳分离并制备了家兔抗血清, 两种麦蚜饲食该蛋白的抗血清后, 传毒效率分别由对照的72.55%和73.44%下降为8.57%和28.56%, 表明该蛋白是参与病毒与介体麦蚜相互识别的传毒相关蛋白. 采用电子显微镜免疫胶体金对50 kD传毒相关蛋白进行麦蚜体内定位, 发现其存在于麦二叉蚜的头部唾液腺组织中, 揭示出麦蚜唾液附腺组织上的膜蛋白与病毒的相互识别是麦蚜能够传播大麦黄矮病毒的根本原因.     

氧钒离子结合于GroEL(HSP60)并促进GroEL的解聚

对钒化合物在线粒体上的可能作用靶点进行研究, 发现氧钒离子在鼠肝线粒体的结合量达(244±58) nmol/mg蛋白, 表观结合解离常数为(2.0±0.8)×10&;#8722;16 mol/L. 使用凝胶排阻色谱将氧钒离子 结合蛋白分离后, 用质谱方法和免疫试验鉴定线粒体中的主要钒结合蛋白为60 kD的热休克蛋白(HSP60). 实验发现, 氧钒离子结合于HSP60后导致HSP60的聚合体GroEL解聚. HSP60是一个关键的分子伴侣, 许多研究表明它参与一些炎症和自身免疫性疾病(如Ⅰ型糖尿病)的发病过程. 因此, HSP60可能是钒化合物体内作用的一个非常重要的新靶点; 其相互作用可能与钒化合物的降血糖、抗癌的药理以及钒的毒性作用有关.     

含卤有机化合物与甲状腺素转运蛋白相互作用的卤代效应

甲状腺素(thyroid hormones,THs)干扰物(thyroid disrupting chemicals,TDCs)能与THs竞争甲状腺素转运蛋白(transthyretin,TTR)的结合位点而影响THs体内平衡.TDCs结构中的卤素基团是影响TDCs与TTR相互作用的关键性结构因子.本研究分析了卤代化合物与TTR的复合物结构和卤代化合物与TTR的相互作用势(logRP),发现卤键和卤氢键、诱导效应和疏水效应是影响有机卤化合物与TTR相互作用的关键因素.卤键(主要是卤氧键)和卤氢键的形成,增强了有机卤化合物与TTR的相互作用.对可电离化合物,诱导效应是卤素基团影响logRP大小的重要因素,疏水效应是卤素基团影响多溴联苯醚(PBDEs)等不可电离化合物与TTR相互作用的主要因素.     

巴西固氮螺菌NifA与PⅡ蛋白之间的相互作用

利用酵母双杂合系统研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasielense)NifA与P_Ⅱ蛋白之间的相互作用. 结果表明: P_Ⅱ蛋白能和完整NifA蛋白自身或其N-端结构域特异结合, 不能与NifA的中间或C-端结构域相互作用; 与P_Ⅱ 蛋白高度同源的Pz蛋白(即GlnK)也不能与NifA结合. 将编码P_Ⅱ蛋白的glnB基因进行移码突变后, 突变的P_Ⅱ蛋白失去了与NifA蛋白结合的功能. 这说明NifA确实可与P_Ⅱ蛋白特异地结合, 但它们之间相互作用的机制尚待进一步研究分析.     

条斑紫菜变藻蓝蛋白立方晶系的初步晶体学研究

蓝绿藻和绿藻中含有的藻胆体是光吸收和传递的功能单位,这些超分子聚集体位于线粒体膜的外表面,可吸收波长从450～650nm的可见光,其光能传递效率接近100%.电子光谱的研究表明藻胆体由核心和天线两部分组成,两部分均由藻胆蛋白和连接蛋白构成.核心部分主要为变藻蓝蛋白(allophycocyanin)所占有,其位于光合膜的外表面,靠近光系统Ⅱ,天线部分包括藻蓝蛋白(phycocyanin)和藻红蛋白(phycoerythrin),藻蓝蛋白靠近变藻蓝蛋白,而藻红蛋白处于天线的顶端.光能传递的途径为:光子→藻红蛋白→藻蓝蛋白→变藻蓝蛋白→光合反应中心的叶绿素a.到目前为止已有数种藻胆蛋白的晶体结构得到了测定.由于变藻蓝蛋白位于核心部位,直接将光能传递给光反应中心,其三维结构的研究一直受到人们的重视.1995年Breic等首次报道了取自单细胞蓝藻钝顶螺旋藻spirulina platensis的变藻蓝蛋白0.23nm分辨率的晶体结构.但红藻和蓝绿藻的出现相差16亿年,其间发生     

利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的

利用低温电镜术和像重构方法测定了兔出血症病毒的三维结构,分辨率达到3.2nm.兔出血症病毒的三维结构显示了杯状病毒的典型特征.位于二十面体二次轴和局域二次轴位置的90个弧状突起以及位于五和三次轴位置的32个杯状凹陷排布在T=3的二十面体衣壳上.因而从结构上表明中国株兔出血症病毒属于杯状病毒科.A,B壳粒之间相互连接,并且杯状凹陷底部未见隆起.兔出血症病毒衣壳壳层区由连续蛋白密度构成,未发现病毒RNA通道存在.从低温电镜像及三维密度图中可以分辨含基因组和含亚基因组两种病毒颗粒的存在.这两种病毒颗粒衣壳结构类似.     

藻类特有的捕光色素蛋白——藻红蛋白的结构、功能及应用

藻胆蛋白(phycobiliprotein, PBP)是红藻、蓝藻和部分隐藻中特有的捕光色素蛋白.自PBP被发现以来,科学家们对其结构、功能及应用进行了深入的研究.藻红蛋白(phycoerythrin, PE)是PBP的一种,由α,β和γ三种亚基组成.其中γ亚基具有连接和稳定的作用,使PE能够以稳定的(αβ)6γ的形式存在. PE可以共价连接藻红胆素和藻尿胆素等色基,对短波长的蓝、绿光具有较强的吸收效率,使红藻和蓝藻能够在深水弱蓝、绿光环境中高效地捕获和传递光能.高纯度的PE与生物素、单克隆抗体等蛋白结合稳定,可以作为荧光免疫等技术中的荧光探针;同时, PE具有抗氧化及抗炎活性,对阿尔茨海默病、肝肾毒、糖尿病等疾病具有一定缓解作用.本文主要对PE的结构、制备及光学活性和生物活性方面的应用进行了综述,并对PE的应用进行了展望,为我国海洋藻类的高值化加工和应用提供参考.