小拟南芥几丁质酶基因cDNA的克隆与序列分析

通过合成1对特异引物，应用RT-PCR技术从小拟南芥总RNA中经反转录克隆出几丁质酶基因，该cDNA基因全长985bp，含有1个963bp的开放阅读框(ORF)，编码321个氨基酸，推测分子量为35．53kD，序列同源性分析表明，该基因与拟南芥几丁质酶基因有93％的同源性。     

扁豆几丁质酶基因的克隆及表达

以扁豆总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增到长度为885 bp的扁豆几丁质酶基因cDNA,其编码294个氨基酸,目的蛋白的分子量为28.429 kDa.以该基因构建pET-21a-chi表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.30℃下,用0.1 mmol.L-1IPTG,诱导5 h,表达产物的酶活力为36.25 U.mL-1.通过常压Sephadex G-50凝胶过滤色谱,DEAE-650C常压与高效离子交换色谱对表达产物进行纯化.目标蛋白达到电泳纯(SDS电泳一条带),几丁质酶的比活力108.42 U.mg-1.表达的蛋白质产物主要以可溶性形式存在.     

几丁质酶和葡聚糖酶生物学特性及其编码基因的克隆和转化

几丁质酶和葡聚糖酶在植物病害生物防治作用中具有重要的作用，本文着重介绍了几丁质酶和葡聚糖酶的分子生物学方面的特性，以及几丁质酶和葡聚糖酶编码基因的克隆和转化研究概况，将编码几丁质酶和／或葡聚糖酶的基因导入到植物中，能够提高植物抗病能力，导入到植物病害生防直菌或细菌中，可以提高生物防治菌的效果。     

里氏木霉几丁质酶基因的克隆及其同源转化研究

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)外切几丁质酶具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性.根据里氏木霉基因组数据库获得了一个编号为21725的外切几丁质酶nagl基因序列,根据检索结果,从里氏木霉QM9414基因组DNA中克隆获得1.9kb的基因片段.构建了以cbhl为启动子和终止子的重组质粒pCbhNag,与含有pyr4基因的质粒pSKpyr4共转化里氏木霉pyr4缺陷株RutC30△U3.共得到99个转化子,初筛得到5株乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活较高的转化子,其中N3菌株的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活可达26.65 U/mL,而出发菌株的胞外几丁质酶几乎无酶活.成功实现了里氏木霉几丁质酶的克隆及同源表达.     

水稻几丁质酶基因(Oschi)cDNA的克隆及序列分析

 以成功克隆大蕉几丁质酶基因（MpChi-1）时设计的一对引物,采用RT-PCR技术从广亲和水稻品种（Oryza．satival L．Cpslo17）中扩增到一水稻几丁质酶的全长cDNA,长1 115 bp,命名为Oschi;此序列已在GenBank中注册,登录号为EU045451;将Oschi基因核苷酸测序结果在NCBI服务器上用BLAST搜索软件进行同源性基因检索;并将Oschi的cDNA序列及氨基酸序列与大蕉及其它单子叶植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树;结果显示此基因具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构;与大蕉核苷酸序列相比同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%,与预测登记的最相近的水稻［Oryza sativa(japonica cultivar-group)］核苷酸序列相比同源性为98%, 氨基酸序列同源性为98%;广亲和水稻Oschi基因与大蕉MpChi-1基因的序列及蛋白结构有较高的一致性。     

脱乙酰几丁质的制备及其对细胞透性和脱乙酰几丁酶活性的影响

虾壳经盐酸和氢氧化钠处理，高锰酸钾漂白，制得几丁质，几丁质经５０％ＮａＯＨ处理，获得脱乙酰几丁质，制得的脱乙酰几丁质能溶于３％醋酸中。植物离体叶片经不同浓度脱乙酰几丁质处理，用电导法和染料结合法，分别测定细胞中电解质和蛋白质的外渗量，用分光光度法测定脱乙酰几丁酶的活性。结果表明，脱乙酰几丁质能使多种植物电解质的外渗量增加，脱乙酰几丁质的浓度愈大，处理的时间愈长，则外渗量增加愈显著。易染赤霉病的小麦品种比抗赤霉病的小麦品种，叶片电解质的外渗量增加。外渗量的增加与脱乙酰几丁质的浓度及处理的时间有关。叶片中蛋白质的外渗与电解质的外渗情况相似，易染病的品种比抗病的品种，蛋白质的外渗量增加７０％－８０％。脱乙酰几丁质处理，使抗病品种叶片中脱乙酰几丁酶的活性增加４０％－６０％。在同样条件下，不抗病品种酶的活性变化不大。文中对所得结果与植物抗病性之间的关系进行了讨论。     

中国棉铃虫多粒包埋型核多角体病毒几丁质酶基因的研究

中国棉铃虫多粒包埋型核多角体病毒VHA273毒株的几丁质酶基因的开放阅读框大小为1713bp，编码570个氨基酸残基，分子量约60kDa，氨基酸序列分析显示，杆状病毒与原核生物特别是细菌的几丁质酶具高度同源性，暗示杆状病毒的几丁质酶基因与细菌的几丁质酶基因有更为接近的讲化关系，可能源于共同的祖先。     

日本沼虾表皮几丁质结合蛋白基因的克隆以及KK-42对其表达的影响

为探讨KK-42缩短日本沼虾蜕皮周期的可能机制,首次从日本沼虾步足表皮组织克隆了编码几丁质结合蛋白的一个新基因——MnCBP-1部分cDNA序列,对其序列进行生物信息学分析,qRT-PCR技术检测MnCBP-1基因的表达水平以及KK-42的影响.结果表明,MnCBP-1基因部分cDNA序列为1396bp,含有特征性的几丁质结合结构域(chitin-bind-4),经BLAST比对,MnCBP-1与蚤状溞相似性为44%.qRT-PCR结果显示,步足表皮组织内MnCBP-1基因表达量随着蜕皮前期(D0-2)的开始逐渐增多.KK-42处理后,蜕皮间期(C)幼虾内MnCBP-1基因表达水平分别在6、12、24和48h比对照组显著升高,而在D0-2期和D3-4期MnCBP-1基因转录物仅在个别时间点有所增多.研究表明,MnCBP-1基因表达与蜕皮周期有关,KK-42处理可显著诱导MnCBP-1基因表达,且表达的高峰提前至C期,这可能是KK-42缩短蜕皮周期的机制之一.     

酿酒酵母蔗糖酶基因的克隆、异源表达及重组酶学性质研究

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到蔗糖酶基因(suc2),并将其克隆到表达载体pSE380中,将得到的重组质粒pSE-suc2转化进E.coli BL21中,利用镍金属螯合层析方法分析测定其酶学性质。重组菌株的SDS-PAGE结果显示重组蔗糖酶基因(suc 2)有60kDa目的蛋白出现,纯化的SDS-PAGE分析得到均一的蛋白条带;重组蔗糖酶的Km值为47.73mmol/L,最大反应速率为79.59mg还原糖mg-1蛋白min-1,最适温度为42℃,最适pH值为5.5,Zn2 、Cu2 对重组蔗糖酶酶活有较强的抑制作用,Ba2 、Mg2 、Mn2 对重组蔗糖酶酶活稍有激活作用。     

结球甘蓝γ-生育酚甲基转移酶cDNA的克隆、分析及其异源表达酶蛋白的功能研究

采用3′-和5′-RACE技术,从结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)幼苗顶芽中克隆了γ-生育酚甲基转移酶的全长cDNA序列(BoTMT).该cDNA长1265bp,包含一个1044bp的开放阅读框,编码包括叶绿体导肽和两个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)在内的347个氨基酸组成的蛋白质.序列分析表明该蛋白质与目前已知的γ-生育酚甲基转移酶有41.8%～86.5%的同源性.半定量RT-PCR结果显示BoTMT主要在结球甘蓝的花和叶器官中表达.将BoTMT的成熟蛋白编码区序列克隆至原核表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产物占菌体总蛋白的22%.体外酶活性测定结果表明表达的蛋白质具有γ-生育酚甲基转移酶活性,能有效地催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚.     

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法,从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因（TreY）,扩增产物大小为2．2kb,将扩增片段与pUCm-T连接,得到重组质粒pUCm-T-TreY,CaCl2法转化DH5α,并筛选阳性克隆。用BamHI／Ndel分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a,连接后得重组pET21a-TreY,转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为74kDa的特异条带,同核苷酸序列所推导的值相符。     

结合区部分缺失的纤维素酶基因的克隆与表达及酶学性质初步测定

从梧桐腐枝上分离到一株可降解纤维素的细菌菌株,发现克隆于该菌株的内切纤维素酶基因(egt)结合区部分缺失(8 bp),导致移码并提前终止,全长1 146 bp,编码381个氨基酸,分子量为40. 06 k D.克隆含有完整结合区的基因(eg),通过酶学性质研究,表明两者均仅具有羧甲基纤维素钠活性,纤维素酶EGT和EG的最适反应温度分别为45℃和55℃,EGT更加耐高温.最适pH均为7. 0,都具有较好的pH稳定性.Mn~(2+)、Fe~(2+)对两者具有激活作用,Zn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、NH_4~(2+)和Mn~(2+)对其都具有抑制作用.EGT的K_m=3. 09 mg/mL,比酶活为98. 4 U/mg; EG的K_m=8. 654 mg/mL,比酶活为53. 53 U/mg. EGT结合区的部分缺失导致酶与底物的亲和能力更好,同时比酶活提高183%,水解能力更强.     

扩展莫尼茨绦虫反应元件结合蛋白基因的克隆和cDNA序列分析

克隆扩展莫尼茨绦虫（Moniezia expansa）新基因,通过生物信息学方法分析该基因的生物学信息,初步预测该基因的功能,为进一步研究扩展莫尼茨绦虫并以其作为模式生物,为人类的某些基因未知功能的研究提供基础。构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克降进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;在NCBI上对该cDNA序列进行开放阅读框（ORF）的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质二级结构的初步预测。结果：获得了1个扩展莫尼茨绦虫基因－应结合蛋白,全长1861bp,编码592个氨基酸,属于DUF906家族,与曼氏血吸虫反应结合蛋白基因具有72．1％的同源性。编码蛋白的理论分子量为69．7653kDa,等电点为9．83.结论：获得了扩展莫尼茨绦虫反应结合蛋白的全长cDNA序列,对该基因功能的初步预测,它是一种基因转录因子,在扩展莫尼茨绦虫虫体中的具体作用机制目前还不清楚,推断该基因的功能在脊椎动物,乃至人类的基因功能研究中具有一定借鉴意义.     

角毛壳菌泛素结合酶基因的克隆和特性分析

利用BlastX将角毛壳菌(Chaetomium cupreum)几丁质诱导的菌丝体cDNA文库中的ESTs序列与NCBI的Nr(Non-redundant)数据库进行相似性搜索,获得泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)基因的ESTs.以此结果设计引物进行RT-PCR,克隆该基因的cDNA序列(CcE2).该序列长600bp,开放阅读框444bp,编码147个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为16.6ku,是亲水性蛋白.BlastP分析表明该基因进化相当保守,与其他真菌的E2具有高度的相似性;三维结构分析显示CcE2仅包含一个功能结构域,在结构域的中央是决定CcE2活性的半胱氨酸残基活性位点.     

基因筛选克隆表达原花青素降解酶及其酶解条件优化的初步研究

针对化学法制备低聚原花青素存在环保压力和副产物多等问题,研究了通过生物酶法降解高聚原花青素来制备低聚原花青素的方法。首先通过基因筛选方法筛选出SananA和EcnanA基因用于酶法降解高聚原花青素,将SananA和EcnanA基因连接在不同质粒载体表达蛋白的结果表明,SananA基因连接在pETDuet-1载体上时的蛋白表达效果较优。进而,利用纯化的SananA蛋白优化高聚原花青素降解条件,结果显示较优的酶解条件为温度50℃、pH=10、反应时间8 h,在此条件下原花青素单体积累量为35.67 mg/g,二聚体积累量为14.49 mg/g。     

草鱼过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)基因 cDNA序列的克隆及其组成型表达

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)是核激素受体超家族成员之一,分α,β,γ 3个亚型,PPAR具有多种生物学效能,对其基因进行研究将有助于揭示草食性鱼类对营养物利用规律及其机制.通过简并引物克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PPAR基因cDNA核心序列,应用3'RACE技术扩增该序列的3'末端序列,并对其进行序列分析,最后用荧光定量PCR方法比较草鱼肝脏、脑、脾脏、肌肉、脂肪和心脏的PPARα、PPARβ和PPARγ基因mRNA相对表达水平.序列分析结果表明,草鱼PPARα、PPARβ和PPARy基因cDNA核心序列片段大小为631 bp,604 bp和651 bp,分别编码210、201和217个氨基酸,PPARy经3'RACE后共获得大小为1 331 bp的片段,编码337个氨基酸.草鱼与鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑马鱼(Danio rerio)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)等鱼类PPAR氨基酸序列同源性很高,为71.4%～96.1%;与人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)等哺乳动物PPAR氨基酸序列的同源性也较高,为65.0%～77.6%;与非洲爪蟾(Xenopus laevis)等两栖动物PPAR氨基酸序列的同源性约为67.0%.荧光定量PCR结果表明,草鱼PPARα于肝脏,PPARβ于肝脏、肌肉和心脏,PPARγ于肝脏的表达相对较高.相同物种不同PPAR亚型的同源性较低,而不同物种同型PPAR同源性很高,反映了不同亚型在结构上的差异,这与其在功能上的差异是相一致的.     

鼠伤寒沙门氏菌JL65色氨酸合酶trpB基因的克隆、测序和相关特性的研究

用ＰＣＲ方法从鼠伤寒沙门氏菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＪＬ６５染色体ＤＮＡ中扩 增了ｔｒｐＢ基因片段,克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ⅱ ＳＫ（＋）质粒上,并用双脱氧未端终止法测定了其 核苷酸序列．ＪＬ６５ｔｒｐＢ基因和ＷＴ Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ｔｒｐＢ基因作比较后,发现仅有３处的核苷 酸差异,其中ｔｒｐＢ基因在的１００位由Ｃ突变为Ａ,１１１位由Ｇ突变为Ａ,１０３０位由Ｇ突变为 Ａ,导致３４位氨基酸残基Ａｒｇ变为Ｓｅｒ,３４４位的Ｇｌｙ变为Ａｒｇ,氨基酸性质均发生变化．说明 是 ｔｒｐＢ１００,ｔｒｐＢ１０３０两处核苷酸的突变使ＪＬ６５的β亚基发生改变,并可能导致ＪＬ６５的冷 敏感．根据互补试验及酶活测定结果,初步将ＪＬ６５ｔｒｐＢ归类于“可修复”的错义突变型．     

金鱼蛋白磷酸酶2A-B"家族Alpha和Gamma调节基因的cDNA克隆及mRNA表达

以金鱼卵巢组织作为材料,运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基B"家族中γ基因(G5PR)cDNA全序列和α基因(PR130)cDNA部分序列.结果显示γ基因cDNA全长1885 bp,编码一个含457个氨基酸的蛋白质.而α基因cDNA长1781 bp,编码的多肽共含426个氨基酸,系α亚基的部分蛋白序列.它们与已知其他物种对应的B"家族蛋白质均有着很高的同源性.结构预测分析发现,α和γ两条多肽均存在PP2A调节亚基B"家族成员共有的两个EF-HAND结构域.用RT-PCR的方法检测了这两个基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平.结果表明,γ亚基在金鱼多种组织和各个胚胎发育时期中均有较高表达且表达量比较平均,仅在卵巢和精巢组织中最为丰富.与γ亚基表达模式相比,α亚基表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性,在卵巢和肌肉组织中最高,在肾脏和鳃中最低,在原肠胚、神经胚、脑泡分化和体色素等胚胎发育时期的表达较弱,而在其他时期中的表达较强.据此,推测α、γ两调节亚基可能在金鱼不同组织和胚胎发育过程中起着特定的作用.此外,进一步的分析发现,α基因除参与PP2A全酶功能外还可能具有独立的功能.     

金鱼蛋白磷酸酶2A—B＂家族Alpha和Gamma调节基因的cDNA克隆及mRNA表达

以金鱼卵巢组织作为材料,运用RTPCR和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆得到蛋白磷酸酶2A（PP2A）调节亚基B＂家族中γ基因（GSPR）cDNA全序列和α基因（PR130）cDNA部分序列．结果显示γ基因cDNA全长1885bp,编码一个含457个氨基酸的蛋白质．而α基因cDNA长1781bp,编码的多肽共含426个氨基酸,系v亚基的部分蛋白序列．它们与已知其他物种对应的B＂家族蛋白质均有着很高的同源性．结构预测分析发现,α和γ两条多肽均存在PP2A调节亚基B＂家族成员共有的两个EFHAND结构域．用RT—PCR的方法检测了这两个基因在金鱼不同组织和胚胎发育不同时期的mRNA表达水平．结果表明,γ亚基在金鱼多种组织和各个胚胎发育时期中均有较高表达且表达量比较平均,仅在卵巢和精巢组织中最为丰富．与γ亚基表达模式相比,α亚基表达呈现明显的组织和胚胎发育阶段差异性,在卵巢和肌肉组织中最高,在肾脏和鳃中最低,在原肠胚、神经胚、脑泡分化和体色素等胚胎发育时期的表达较弱,而在其他时期中的表达较强．据此,推测α、γ两调节亚基可能在金鱼不同组织和胚胎发育过程中起着特定的作用．此外,进一步的分析发现,α基因除参与PP2A全酶功能外还可能具有独立的功能．     

高温解烃菌NG80-2黄素还原酶基因的克隆、表达及其酶学性质研究

对1株高温解烃菌NG80-2黄素还原酶基因,nfr进行了克隆,并在E.coli BL21中实现高效表达.对纯化的Nfr酶学性质进行研究,发现Nfr可以利用NADH、NADPH、FMN、FAD分别作为供氢体和氢受体,其中NADPH和FMN为最适底物.Nfr的最适反应温度为60～70℃,最适反应pH为5.0.在耐受性试验中,此酶在65℃高温中保温30 min后可保持47.3%的相对酶活.在受试的金属离子中,Fe2+对酶活性的抑制作用最大.