烟草K326叶肉原生质体培养再生植株及影响因素的研究

以烟草K326无菌苗为材料,成功地将烟草叶肉原生质体培养出再生植株.并同时就烟草叶肉原生质体的酶解条件、培养方法及培养基中的激素组成等因素对植株再生的影响进行了研究和探索.     

烟草原生质体的制备和分析

植物原生质体作为一个良好的实验系统,广泛应用于植物分子及细胞学研究中.本研究以烟草NC89叶片为材料,采用酶解法制备烟草原生质体,经台盼蓝染色鉴定活性,结果显示,分离纯化后的原生质体产量为(12.7±1.6)×106 g-1,表明该方法能成功地制备高产率、高活力的原生质体,建立了一种烟草原生质体的简易制备方法.     

快捷、简单、有效的原生质体计数方法

<正>1960年Cocking用酶法首次分离出了有活性的原生质体。1971年Takebe等从烟草叶片分离原生质体,经培养获得再生植株,原生质体的研究和应用     

皱叶莴苣_菜心_胡萝卜及其它几种植物原生质体分离方法的初步探索

近年来,原生质体的分离和培养已获得较大的突破,如烟草、胡萝卜、马铃薯、矮牵牛、石刁柏等多种植物已能从原生质体再生成完整的植株,有些作物已从原生质体诱导出愈伤组织,如水稻、玉米等.分离的原生质体,不但能诱导再生成完整植株,还能通过原生质体的融合或摄入外源核酸或细胞器,使具有不同类型遗传特性的原生质体形成杂交细胞,进而打破有性杂交不亲和性的界限,开辟植物遗传育种的新途径.由此可见,原生质体的制备和培养研究是植物体细胞杂交工作中的首要环节.本文对华南栽种的几种作物,初步探索了其原生质体分离的适合方法.     

烟草原生质体活力检测和细胞核染色方法的研究

本试验以烟草叶片和烟草悬浮系制备的原生质体为材料,采用不同染料对原生质体活力和细胞核进行染色效果比较.结果表明,原生质体活力观察宜采用荧光素双醋酸酯（FDA）染色法,染色效果清晰易于观察,四嘧唑蓝（MTT）法则可定量反映原生质体活力;相对于其他细胞核染料,DAPI对不同来源的原生质体细胞核染色效果均较好,能够清晰地对原生质体进行观察和计数.本研究为今后原生质体的检测提供有用的参考.     

烟草叶肉原生质体分离和纯化研究

实验比较了从烟草K326叶片分离叶肉原生质体的若干影响因素.结果表明,质壁分离的时间、酶液浓度、渗透压及酶解时间是影响原生质体产量和质量的决定性因素.研究结果对建立高效的烟草原生质体再生系统及其遗传操作有参考价值.     

植物内源激素对原生质体培养的影响

以烟草试管苗叶，美味猕猴桃，毛花猕猴桃子叶愈伤组织以及玉米叶片为材料，进行了内源激素水平的测定和原生质体培养的研究。结果表明，高水平内源玉米素核苷含量和高ＺＲ与吲唑乙酸质量比有利于原生质体再生细胞的分裂；高水平内源脱落酸对再生细胞分裂有抑制作用，内源ＩＡＡ，ＺＲ和ＡＢＡ含量对原生质体培养的影响在不同种之间存在差异。     

烟草叶肉原生质体再生壁形成中的呼吸途径Ⅱ.TCA途径

壁的再生是原生质体生命活动中最重要的行为之一。这种行为是建立在代谢基础上的。前文我们已报道了再生壁形成中,EMP(糖酵解)和HMP(戊糖支路)呼吸途径起了重要作用,但对于TCA(三羧酸循环)途径尚未研究。本文系报道应用TCA呼吸途径的抑制剂丙二酸钠对烟草叶肉原生质体再生壁形成中的作用进行的研究结果。材料与方法选择烟草(Nicotiana tabacum)叶片为材料,按前法分离叶肉原生质体。原生质体的培养按前法进行。丙二酸钠附加于NT培养基中,经高压灭菌后接种。检查原生质体细胞壁的再生,用荧光增白剂VBL染色荧光法。细胞面积的计算按前法。     

烟草和元麦叶肉原生质体种内电融合

利用 DR-1型多功能细胞电融合仪分别对烟草和元麦(正常及黄化)的叶肉原生质体进行种内电融合研究。当正弦交变电场强度分别为40～50伏/厘米及33～37伏/厘米时,烟草、元麦的叶肉原生质体能在电极间排列成串;这时若施加电压分别为120～200伏、100～140伏和100～110伏,脉宽为25微秒的脉冲电场于烟草、正常和正常元麦、正常和黄化元麦叶肉原生质体时,就会出现原生质体局部接触区发生质膜的可逆性击穿,形成融合体。     

烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究

利用PEG法、高Ca2 高pH法和PEG-高Ca2 高pH法等三种原生质体融合方法,对普通烟草K326和黄花烟草叶肉原生质体进行融合,结果表明,PEG-高Ca2 高pH法的有效融合率最高,融合效果最好.并同时对影响烟草叶肉原生质体融合的其它因素进行了研究和探讨.     

植物细胞工程进展

概要介绍了植物细胞工程的主要分支学科及其研究进展。包括原生质体培养、细胞融合与体细胞杂交、胚胎培养和试管受精、组织和细胞培养生产有用物质、单倍体育种、体细胞无性系变异、细胞突变体的筛选、植物快速繁殖技术、体细胞胚胎发生和人工种子、组织细胞培养物的超低温保存以及转基因植物等。     

烟草原生质体的分离纯化

研究从烟草叶片分离原生质体的若干影响因素.通过酶解法降解细胞壁释放出原生质体,利用离心和蔗糖漂浮法从粗提取液中纯化出原生质体,并通过血球计数板计数来比较制备的效果.结果表明:酶的种类、质膜稳定剂、渗透压稳定剂、pH及酶解时间是影响原生质体制备的重要因素.纤维素酶含量2%,果胶酶含量1%,2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)浓度50mmol/L,Ca2+与甘露醇作为渗透压稳定剂,pH6左右,温度28℃,酶解时间4h时原生质体的分离效果最佳.     

烟草和元麦叶肉原生质体种内电融合

利用ＤＲ－１型多功能细胞电融合仪分别对烟草和元素（正常及黄化）的叶肉原生质体进行种内电融合研究。当正弦交变电场强度分别为４０－５０伏／厘米时，烟草，元麦的叶肉在生质全能在电极间排列成串；这时若施加电压分别为１２０－２００伏，１００－１４０伏和１００－１１０伏，脉宽为２５微秒的脉冲电场于烟草，正常和正常元素，正常和典化元素叶肉原生质体时，就会出现原生质体局部接触区发生质膜的可塑性击穿，形成融合体。     

烟草悬浮系培养与细胞器的分离

通过诱导BY-2型烟草叶片愈伤组织,进一步建立烟草细胞悬浮系．酶解去壁从细胞悬浮系中获得原生质体,用含有0．5％Triton X-100的CSK缓冲液破裂细胞膜,释放出细胞器,再通过不连续的蔗糖,Percou梯度进行速率区带离心,分离纯化出细胞核和叶绿体,通过分离、纯化细胞核的对照实验证明不同培养条件对烟草细胞悬浮系的生长和周期具有显著影响。     

植物原生质体培养与遗传操作

一、植物原生质体培养和细胞融合的一些进展 1960年,E.C.Cocking用酶法从高等植物细胞中分离得原生质体,为高效地从高等植物中分离原生质体打开了局面。迄今已能从几乎所有的植物薄壁细胞中分离得生活的原生质体,并对种类日渐增多的植物原生质体进行培养。据不完全统计,迄今世上已能使近百种植物由原生质体培养成植株。在我国,除早年已由胡萝卜、菸草和矮牵牛等原生质体再生植株外,近年对园艺、药用、经济植物和禾谷类植物的十个科约24种植物,用原生质体培养物再生了植     

ABA对拟南芥los5-1突变体及其野生型保卫细胞质膜内向K~+通道的调节

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)ABA缺失突变体los5-1及其相应野生型为材料,用细胞质膜钙离子通道的抑制剂LaCl3和细胞内钙离子的螯合剂EGTA处理,运用膜片钳技术探讨在ABA调节突变体和相应野生型保卫细胞质膜内向K+电流过程中Ca2+的作用.实验结果表明ABA均可以明显抑制拟南芥C24野生型及其突变体los5-1保卫细胞原生质体的内向K+电流,而且ABA对los5-1突变体及其相应野生型保卫细胞质膜内向K+通道的调节具有不同的Ca2+依赖性,说明ABA对突变体和野生型的K+通道     

植物原生质体获得、培养条件及方法对其再生体系构建的影响

概述了植物原生质体再生体系中原生质体获得、培养条件及培养方法等关键技术环节,并且对完善植物原生质体再生体系及今后工作方向提出了建议.     

一个特殊的顺式发夹核酶对感染烟草原生质体的影响

研究一个烟草花叶病毒(TMV)cDNA3′末端被特异切割的发夹核酶对感染原生质体的作用。选用一个外源基因绿色水母荧光蛋白(GFPuv)作为报道基因，取代了大部分的CP编码区域，以研究在烟草原生质体中发夹核酶对TMV载体的复制，通过GFP的表达来确定表达量。顺式发夹核酶对TMV载体感染效率的影响通过体外转录来观察。TMV GFPRIB体外转录感染原生质体的效率比与其不含该核酶的对应物的感染效率高3～5倍。Northern杂交结果表明，包括核酶在内的3’末端非病毒序列在体外转录反应开始后就被顺式发夹核酶切除了。当直接用载体DNA pSTMVGFPRIB感染原生质体时，感染原生质体的数量比与之相对应的pSTMVGFP NOS感染原生质体数多50％～80％。     

小麦赤霉菌FGSG__04871基因敲除及功能研究

应用Split-Marker基因敲除技术,构建含有潮霉素抗性基因hph的基因敲除盒,由PEG介导,进行原生质体转化,在含有潮霉素的培养基上筛选转化子,应用PCR正负筛查确定缺失突变体.根据缺失突变体致病性的检测及表型变化对FGSG_04871基因的生物学功能进行分析.通过PCR正负筛选成功获得了3个敲除突变体,分别命名为△FGSG_04871 1-1、△FGSG_04871 1-3、△FGSG_04871 2-1.以野生型PH-1作为对照,敲除突变体的菌落形态没有明显变化,菌落生长速度略微滞后,致病力没有减弱.但是,突变体的产孢量低于野生型PH-1,因此,FGSG_04871基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关.     

核酶转基因载体的构建及在烟草原生质体中对TMV感染的抑制作用

设计切割烟草花叶病毒RNA的锤头型核酸Rz－2，分别以pKyLx7和pBin19为载体，构建含Rz－2基因及核酸和底物连接的RzSb－2基因的重组质粒，通过三亲交配将目的基因转入土壤农杆菌中的Ti质粒．重组Ti质粒通过PEG法转化烟草原生质体，同时对转化的原生质体接种TMVc一定时间后以半叶法检测原生质体中病毒的侵染性．结果表明转基因原生质体中TMV侵染性明显低于未转基因的对照，推测病毒在转基因的原生质体中复制受到干扰；且核酸Rz－2（正向）表达后作用最为明显，核酸连底物RzSb－2（正向）与RzSb～2（反向）之间有明显差别．