酶形式差异的三酶系统一步法转化头孢菌素C制备7-氨基头孢烷酸

【目的】对酶形式差异的三酶系统一步法裂解头孢菌素C(CPC)制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)进行研究。【方法】对重组大肠杆菌分别进行摇瓶和发酵罐高密度表达,获得最高酶活后使用两个形式差异的三酶系统一步法转化CPC制备7-ACA。【结果】相较于摇瓶发酵,发酵罐发酵获得的酶活更高,发酵罐上对重组大肠杆菌的高密度表达发现,补料流加总量为400mL的甘油混合液(15%甘油+7.5%鱼蛋白胨,W/V),发酵72h后菌浓度达到32.79g/L、最高的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GA)和过氧化氢酶(CAT)活力分别为7 099.85U/L和15 776.20U/L。利用一个三酶系统包括固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)、游离GA和CAT,一步法催化CPC获得的7-ACA生成率为87.28%;而另一个三酶系统包括固定化DAAO、冻融细胞GA和CAT一步法催化CPC获得的7-ACA生成率为87.10%。【结论】两种酶形式差异的三酶系统一步法制备7-ACA的得率大致相等。GA对α?酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(AKA-7-ACA)的特异性和水解能力较差,限制了该工艺运用。     

7-氨基-3-乙烯基头孢烷酸的合成

7-氨基-3-乙烯基头孢烷酸(7-AVCA)是合成头孢地尼和头孢克肟的重要中间体。以7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-头孢烷酸对甲氧基苄酯(GCLE)为起始原料,经Wittig反应,酶解得到7-AVCA。实验结果表明:当n(NaI)∶n(NaBr)=1∶3时,可大大降低生产成本,且不影响产品收率;当V(CH2Cl2)∶V(CH3OH)=1∶4时,7-苯乙酰氨基-3-乙烯基-4-头孢烷酸对甲氧苄酯(GVNE)的收率为93%,纯度为98.5%;在高效液相色谱的质量分数w(HPLC)0.2%时,产品的收率为85%(以7-苯乙酰氨基-3-氯甲基-4-头孢烷酸对甲氧基苄酯(GCLE)记的产品),纯度为99.8%。该合成路线步骤简单、条件温和,对环境污染小。     

7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸研究及生产技术现状

综述了以青霉素 G钾盐为原料 ,制备 7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 ( 7-ADCA)的方法。总结了扩环反应的反应机理、扩环催化剂的种类及由头孢烷酸转化成 7-ADCA的方法。评述了各种扩环催化剂的催化特点。     

7-氨基头孢烷酸结晶过程聚结现象与晶体表面性质

对7-氨基头孢烷酸（7-ACA）两种结晶方法的聚结现象进行研究．通过对结晶过程不同pH值下晶体SEM照片的比较，发现酸法结晶过程在pH值大于1．5时开始出现花朵状聚结，而碱法结晶不发生聚结；通过时两种结晶方法得到样品的SEM照片处理，发现酸法和碱法样品SEM灰度具有自相似性，应用盒子维法分别求得两种结晶过程中不同pH值下的晶体的分维值．测定了7-ACA在不同pH值水溶液中的Zeta电位．通过毛细升高法测定了酸法和碱法样品对水与丙酮的润湿角，结合两种样品的X-粉末衍射和红外衍射图谱，对晶体表面的官能团进行了推测．     

低pH条件下酸诱导的氨基酰化酶的折叠研究

在低离子强度下，随着ｐＨ的降低，氨基酰化酶的构象逐渐伸展，至ｐＨ２．０附近去折叠程度达到最大，但ＣＤ光谱测量的结果表明此时酶分子仍具有一定的二级结构。通过增加ＨＣｌＯ４的浓度，使ｐＨ进一步降低，ＣｌＯ＾－４阴离子诱导氨基酰化酶发生协同性的再折叠过程，使酶分子的构象从伸展状态成与“融球结构”类似的状态，即分子折叠过程，使酶分子的构象从伸展状态转变成与“融球结构”类似的状态，即分子折叠至一定的紧密程度     

CPC酰化酶基因的人工合成与重组表达

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是头孢菌素类抗生素的中间体,在医药工业中具有重要的应用价值.该文通过人工设计、合成并在重组大肠杆菌中表达头孢菌素C(CPC)酰化酶基因来实现7-ACA的一步酶法催化合成.以Pseudomonas sp.SE83菌株的CPC酰化酶蛋白质序列为模板.对CPC酰化酶基因分两段进行了全局优化设计,包括密码子替换、鸟嘌呤和胞嘧啶含量调整以及酶切位点修改等.通过装配聚合酶链式反应方法最终获得了目标基因,并克隆至表达载体pET-28a,成功构建了诱导型重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28-acy.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,在Luria-Bertani培养基中,新建重组大肠杆菌所表达的可溶CPC酰化酶占菌体总蛋白的75%以上;经优化培养基摇瓶发酵,重组菌的CPC酰化酶酶活高达2 956U/L.采用上述方法获得的CPC酰化酶,在一步酶法合成7-ACA的工业化生产中具有广阔的应用前景.     

SDS滴定时氨基酰化酶的溶液构象和活力变化的研究

本文以荧光发射光谱和紫外差吸收光谱的方法，研究了ＳＤＳ滴定氨基酰化酶溶液时构象变化的情况，同时测定了相应的物的活力的变化。实验结果发现酶的构象变化程度与相应的失活的程度大致平行。这表明酶基酰化酶构象的完整性是酶具有催化活力的基础。     

（4S）-4-苄基-2-嗯唑烷酮的N-酰化研究

氢化钠作用下,（4S）-4-苄基-2-嗯唑烷酮与酰氯反应,合成了N-酰化（4S）-4-苄基-2-嗯唑烷酮化合物,与其他方法相比,该方法操作简便,产率可达到85％以上．     

1，1’-螺二茚烷-7，7’-二羧酸的制备

光学纯的1，1’-螺二茚烷-7，7’-二醇与三氟甲磺酸酐反应得到的三氟甲磺酸酯在钯催化剂作用下发生羧甲基化反应生成1，1’-螺二茚烷-7，7’-二羧酸甲酯，进一步水解以大于90％产率得到相应的羧酸．     

Rapid Cloning and Expression of Glutaryl-7-Aminocephalosporanic Acid Acylase Genes from Soil Samples

A polymerase chain reaction （PCR）-based strategy was developed to rapidly obtain the gene encoding for an industrially important enzyme, glutaryl-7-aminocephalosporanic acid （GL-7-ACA） acylase.Different soil samples were cultured with a Pseudomonas selective medium to enrich specific microorganisms, and then the genomic DNA was extracted to serve as PCR templates. PCR primers for GL-7-ACA acylase gene amplification were designed on the basis of bioinformatics searches and analyses.The method was used to successfully amplify three GL-7-ACA acylase genes from different soil samples.The GL-7-ACA acylase genes were then cloned and overexpressed in Escherichia coil with a relatively high level of 266 unit · L^-1.     

金属螯合载体一步纯化与固定化GL-7ACA酰化酶

采用金属鳌合亲和层析技术,以EIP-ARFG-IDA-Co2+为载体,从可溶性总蛋白中一步分离纯化具有His-tag标签的GL-7ACA酰化酶.在此基础上进行了固定化方面的研究,其固定化最适条件是150～200U/g给酶量与载体比,固定化时间16 h,固定化介质pH=7.0.固定化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0.同时还考察了固定化酶的热稳定性、重复利用性及载体的重复使用等特性.     

气相色谱法测定马齿苋中的EPA和DHA

本文采用气相色谱法测定马齿苋中的ＥＰＡ和ＤＨＡ。用ＦＩＤ检测器检测定量。方法检测限：ＥＰＡ为９．６×１０＾－１０ｇ;ＤＨＡ为６．８×１０＾－９ｇ。相对标准偏差：ＥＰＡ为１．８７％;ＤＨＡ为３．６６％。平均回收率：ＥＰＡ为９８．１％,ＤＨＡ为９６．２２％。     

青霉素酰化酶工程菌的褐藻胶固定化

本文报告以褐藻胶(海藻酸钠)固定化青霉素酰化酶工程菌的方法。本方法对大肠杆菌的包埋量可达30～40％(W/W),酶活回收率为88％。本文对6-APA测定的PDAB法进行了改进;对固定化细胞酶活的测定提出一种新方法。     

高效测定水果中有机酸的反相液相色谱法

应用卡瑞(Carrez)试剂处理水果样品,采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定了梨、苹果、草莓、油桃等水果中维生素C及其他共8种有机酸成分.在以C8为色谱柱、紫外检测器(波长214nm),甲醇和磷酸盐缓冲液(pH=2.6)作为流动相梯度洗脱,流速为0.5mL·min-1,柱温为25℃的色谱条件下,1次同时分析水果中8种有机酸仅需6min,有机酸标准曲线相关系数均在0.9995以上,回收率在93.01%～101.79%之间,变异系数小于4%.该方法简便、准确、快速,样品制备方法独特、有效,可应用于水果中常见有机酸的高效检测.     

薄层分析法快速分析银杏酸的方法研究

建立了一种薄层分析法,用于快速分离和分析银杏叶提取物(EGb)生产过程中银杏酸的含量,并通过其他的定性方法对分离的样品进行了鉴定,确定提取物中包含了银杏酸类的5种代表性成分。回归方程为：Y=-2020．8 2644．9X(r=0．9986),线性范围：0．77～15．0μg,检测下限0．27ng。加样回收率100．8％,RSD为1．9％。该方法简单、易行,尤其适合EGb生产过程中对银杏酸含量的监控。     

气相色谱法快速测定一氯乙酸

将乙酸及氯化乙酸在适当条件下酯化为相应的乙酯，经氯仿萃取后用气相色谱法测定。其特声、是色谱柱制备简单，分析重现性好，能准确快速地测定乙酸及氯化乙酸的混合物。     

酸性染料比色法测定蒙成药道古勒·额布斯—7汤中苦参总生物碱的含量

采用酸性染料比色法测定道古勒·额布斯— 7汤中苦参总生物碱的含量 ,结果平均回收率为 98 3% ,RSD =0 70 % ,线性范围为 3 33～ 16 6 7μg/ml.     

水果中的萘乙酸残留测定

采用气相色谱法测定了水果中的萘乙酸残留量,并对方法的灵敏度、准确度及各种影响因素进行了探讨,线性范围为0—4.0mg/L,重复性好,平均回收率为96.9%,结果令人满意.     

液相色谱法测定大鼠血清中IgG的研究

目的建立一种用于测定大鼠血清中IgG的液相色谱法。方法根据被分析物质的性质,以HI-Trap Protein G柱为分离柱,以磷酸盐缓冲液和甘氨酸盐酸缓冲液为流动相,采用梯度洗脱方式,选择0.8mL/min流速,检测波长为280nm。结果浓度在0.5～1.5mg/mL浓度范围内IgG与峰面积呈良好的线性关系,以信噪比为10计算最低检测浓度为0.31mg/mL,平均回收率为90.5%。结论试验结果表明该方法可行,快速简便,准确可靠。