大黄鱼Rnd1基因表达载体构建及表达模式分析

为探究Rnd1基因在大黄鱼免疫应答过程中的作用,采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）对该基因的表达模式进行分析,同时构建原核表达载体pET-28a-Rnd1,并转化进大肠杆菌后诱导该蛋白的融合表达。研究结果表明:大黄鱼Rnd1基因ORF为699 bp,编码232个氨基酸;经序列多重比对和进化树构建发现,Rnd1的氨基酸序列高度保守;在健康大黄鱼的8个免疫组织中,Rnd1在肝脏中相对表达量最高,其次为脑,而在肠中表达量最低;变形假单胞菌攻毒后,Rnd1在肝脏中48 h时达到最高值,为对照组的25倍;在脾脏中则持续上调表达,尤其在48 h后升高更为明显。     

一种定量检测大黄鱼感染变形假单胞菌方法的建立与应用

变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)是引起大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要病原。基于变形假单胞菌的gyrB基因与大黄鱼的单拷贝基因gdf-8分别设计1对特异性引物,对所设计的变形假单胞菌gyrB基因的引物特异性进行了检验,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了400尾人工浸泡感染变形假单胞菌5 d后的大黄鱼幼鱼脾脏中的病原菌的相对含量。结果显示,基于gyrB基因所设计的引物对变形假单胞菌检测具有良好的特异性,可以用于对变形假单胞菌的定性和定量检测;400尾人工攻毒大黄鱼幼鱼脾脏中变形假单胞菌的相对含量(相对带菌量,用gyrB基因拷贝数与大黄鱼gdf-8基因拷贝数之比表示)变化在5.04×10~(-7)～0.482之间,不同个体之间的相对带菌量差异很大,说明不同个体的大黄鱼对变形假单胞菌感染的抵抗力有很显著的差异。     

温度对大黄鱼源变形假单胞菌胞外产物酶活力的影响

为了研究大黄鱼源变形假单胞菌胞外产物的致病性,在内脏白点病的高发温度（18 ℃）培养大黄鱼的病原菌——变形假单胞菌,利用玻璃纸覆盖平板技术制备其胞外产物,测定不同温度（低温不致病温度12 ℃、高发致病温度18 ℃和高温不致病温度28 ℃）下其胞外产物的酶活力.结果显示:变形假单胞菌胞外产物的淀粉酶、丝氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类、类胃蛋白酶、类糜蛋白酶、卵磷脂酶、酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活性受温度影响比较大,28 ℃条件下酶活力显著（P＜0.05）高于12 ℃或者18 ℃时的酶活力;半胱氨酸蛋白酶类、氨肽酶的活性和溶血活性受温度影响没有显著性变化（P＞0.05）.实验结果表明,虽然变形假单胞菌胞外产物是其致病因素之一,但大黄鱼内脏白点病在特定温度（16~20 ℃）下高发并非是由于胞外产物在该温度下的活性较高.该结果增进了对大黄鱼内脏白点病发病机理的认识.     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因在荧光假单胞菌中的表达

将已克隆到的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans)C-2的几丁酶基因chi1片段克隆到质粒载体pUXBF5中，得到重组质粒pUXCH1，该重组质粒在大肠杆菌中可以表达产生具有生物活性的几丁酶并分泌到胞外。将pUXCH1分别利用感受态法和三亲本杂交法转化荧光假单胞菌（Psendomonas fluorescens），在含有卡拉霉素的金氏B平板上筛得转化子。但将转化子点种于几丁质平板上却不能产生水解圈，提取细胞内容物后用比色法也没有检测到有效的酶活性。该研究表明环状芽孢杆菌 的几个酶基因chi1已经被成功的整合到荧光假单胞菌的染色体上，但却没有表达或表达效率极低，这可能是由于荧光假单胞菌的表达系统不能正确有效的识别存在于该chi1几丁酶基因片段中的环状芽孢杆菌基因启动子而造成的。     

导入脂肪酶基因提高荧光假单胞菌26-2的产酶效率

采用导入脂肪酶基因的方法对荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescence）26—2的产酶效率进行实验。实验以质粒ppic9k—lipA为模板,通过PCR的方式在26—2脂肪酶基因的两端引入BamHl和EcoR1的酶切位点,并将该基因与大肠杆菌荧光假单胞菌穿梭质粒pDSK 519连接,获得重组质粒pDSK519-lipA,再将重组质粒转入荧光假单胞菌26—2,获得工程菌株P．fluorescence 26—2—1。在相同的发酵条件下,工程菌株的发酵液酶活力比原始菌株的发酵液酶活力提高2倍,实现了荧光假单胞菌脂肪酶基因的同源性表达。     

番茄青枯病拮抗菌的筛选及防治效果

为了筛选出具有抑制青枯雷尔氏菌作用的拮抗菌,采用形态指标、生理生化特征以及16S rRNA序列分析等方法对菌株进行了研究,并且通过阴性对照（CK）、番茄青枯病菌阳性胁迫处理（RB）和拮抗菌K+番茄青枯病菌处理（KRB）3个盆栽番茄土壤样品进行了防卫反应基因的表达研究.结果表明,拮抗菌K5菌落呈乳白色且表面光滑,经革兰氏染色为阳性,初步确定为芽孢杆菌,通过分子鉴定后确定为贝莱斯芽孢杆菌;番茄青枯病的盆栽防治效果达到23.20%,K5菌株在接种48 h后能诱导番茄根部抗病基因表达,CTR、ETR基因的表达量提高,表明K5通过植物抗病相关基因的表达,能诱导植物产生抗病性,并能有效地抑制青枯病菌的繁殖,从而达到防治青枯病的作用.     

大黄鱼人工感染杀香鱼假单胞菌的病理形态学及病原分布的初步研究

为了研究杀香鱼假单胞菌在感染大黄鱼体内的分布状况及其所致各器官的病理损伤特点,通过人工回感试验,利用组织切片及免疫组化技术对感染大黄鱼的肝脏、脾脏、肾脏及鳃组织进行了组织病理切片,并进行HE染色和免疫组化分析。结果显示,人工感染发病大黄鱼临床症状与自然感染发病症状一致,病鱼体表无明显病症,但肝、脾、肾等内脏有大量白色结节;组织病理显示,病鱼肝脏、脾脏和肾脏是感染损伤的主要靶器官,内脏组织发生变性、坏死以及出现特征性的病理性结节;免疫组化检测特异性阳性信号出现在病鱼内脏组织器官的血窦或血管以及巨噬细胞内。研究表明,杀香鱼假单胞菌侵入鱼体后,主要分布在机体的血液中并大量增殖,通过血液循环到达鱼体各内脏器官;杀香鱼假单胞菌在鱼组织内的分布与其所致病理损伤之间呈正相关。     

核黄素诱导番茄抗病性与Pti蛋白激酶基因表达

研究了核黄素诱导番茄对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudom onas syringaepv.tomato）的抗性及相关防卫反应.核黄素诱导处理后,番茄对P.syringaepv.tomato的抗性增强,蛋白激酶基因Pti4,Pti5,Pti6和抗病防卫基因PR-1a,GluA,GluB,ChtA,ChtB表达量提高,水杨酸含量明显升高.蛋白激酶抑制剂K252 a可以部分抑制这些基因的表达,取消核黄素对水杨酸的诱导作用,可减弱诱导抗病性的程度.这些结果表明,核黄素诱导的抗病性受植物细胞内多种信号传导因子控制.     

衡阳地区绿脓假单胞菌临床分布特征及耐药性分析

目的了解衡阳地区绿脓假单胞菌的临床分布特征及耐药现状，为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法收集衡阳市南华大学附一医院临床分离的199株绿脓假单胞菌，采用K—B法检测药物敏感性。结果199株绿脓假单胞菌中，以痰液为主，占64．32％（128／199）；其次为伤口分泌物，占9．05％（18／199）。病区来源以ICU检出率最高，占14．07％（28／199）；其次为神经外科和呼吸内科，占9．05％（18／199）。在检测的19种药物中，耐药率超过50％的达13种（68．42％），耐药率最高为氨苄西林／舒巴坦（98．00％），其次为复方新诺明（95．00％）和替卡西林（79．00％），耐药率最低为多粘菌素E（8．00％）。结论临床分离绿脓假单胞菌多来源于呼吸道标本，且耐药现象十分严重。临床应加强对绿脓假单胞菌耐药性监测、合理选用抗菌药物。     

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法,首次从大黄鱼中克隆到全长为2 023 bp的凝血酶原类似基因cDNA,编码为617个氨基酸,其中包括80 bp的5′末端非编码区及89 bp包含poly(A)尾的3′末端非编码区。预测1~15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较,发现其与红鳍东方鲀有73%同源性,而与哺乳动物的同源性为50%~65%。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达,但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调,这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。     

大黄鱼Hepcidin基因转录物的相对定量分析

以大黄鱼(Pseudosciaena crocea)管家基因18S rRNA和β-actin作为内参基因,分别比较2个内参基因建立的相对定量曲线,最终确立以18S rRNA为参比基因,定量分析大黄鱼的Hepcidin抗菌肽基因.该相对定量分析方法所得结果与Northern-blot方法一致.应用建立的Hepcidin基因的实时荧光相对定量研究方法,对大黄鱼头肾中的Hepcidin基因转录物进行相对定量,为今后开展鱼体内免疫相关基因的表达特性、诱导机制等工作奠定研究基础.同时,克隆得到的大黄鱼β-actin基因和18S rRNA基因片段已提交基因库,并获得登录号.     

大黄鱼幼鱼对低盐度的耐受性研究

通过设置盐度的突变和渐变实验研究了大黄鱼幼鱼对低盐度的耐受性.结果表明:在盐度突变实验中,将大黄鱼幼鱼直接从海水（盐度27.2）移入盐度为3～24的水中,72 h内不会导致明显死亡;从海水移入盐度为2的水中,72 h的存活率可达72%;从海水移入盐度为1的水中,3 h后开始出现死亡,24 h内大部分死亡;从海水移入淡水中,6 h内全部死亡.在盐度渐变实验中,将大黄鱼幼鱼从海水直接移入盐度为6的水中后,再以不同的幅度降低盐度,在盐度高于3时,大黄鱼幼鱼的死亡率与相应盐度的突变实验相比无明显差异;在盐度低于2时,大黄鱼幼鱼的死亡率低于相应盐度的突变实验的结果.研究表明,大黄鱼幼鱼具有较高的低盐度耐受力     

大黄鱼与黄姑鱼杂交F_1及其双亲的核型分析

研究了大黄鱼与黄姑鱼正反交F1原肠早期胚胎细胞及其亲本头肾细胞的染色体核型,为深入剖析大黄鱼与黄姑鱼杂交后代的基因组构成提供了细胞遗传学证据.大黄鱼与黄姑鱼染色体组均含有48条端部着丝粒染色体,染色体组型公式均为2n=48 t,染色体臂数均为NF=48,组内染色体长度分布连续.两亲本物种间核型很相似,未找到鉴别两物种的细胞遗传标志.正反交F1原肠期胚胎细胞的染色体众数也均为48,均可较好地配为24对.结合前期AFLP分析结果可以推断,正反交胚胎细胞均同时含有一个大黄鱼染色体组和一个黄姑鱼染色体组.此外,杂交F1中的非整倍体比例与两亲本没有明显区别,初步表明杂交胚胎细胞未发生明显的染色体丢失.在黄姑鱼♀与大黄鱼♂杂交F1中出现4对非t-染色体,原因尚待查明.     

大黄鱼Ghrelin基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR、RACE等技术,从大黄鱼胃组织中克隆得出Ghrelin基因的cDNA(649 bp),其中包含5'非翻译区(5'UTR),起始密码子,信号肽、成熟肽、C-端肽序列的编码区,终止密码子,3'非翻译区(3'UTR)和相对较少见的多核苷酸化信号(ATTAAA).获得的cDNA编码108个氨基酸,与已报道的硬骨鱼类Grelin mRNA比对显示,相似性(Similarity)和一致性(Identity)最高(黑鲷 Acanthopagrus schlegelii)可达81%和73%,推测的成熟肽包含硬骨鱼Ghrelin的相同活性中心和修饰位点,证明是鱼类Ghrelin同源基因.     

大黄鱼染色体核型研究

采用秋水仙素腹腔注射,肾细胞直接制片法对取自厦门市火烧屿网箱的养殖大黄鱼进行染色体核型分析,结果表明：大黄鱼具有４８条Ａ型染色体,核型公式为２ｎ＝４６ｔ＋２ｓｔ,ＮＦ＝４８。     

Effects of fish protein hydrolysate on growth performance and humoral immune response in large yellow croaker (Pseudosciaena crocea R.)

We investigated the effects of fish protein hydrolysate (FPH) on growth performance and humoral immune response of the large yellow croaker (Pseudosciaena crocea R.). One thousand and two hundred large yellow croakers [initial average weight: (162.75±23.85) g] were divided into four groups and reared in floating sea cages (3 m×3 m×3 m). The animals were fed with 4 diets: basal diet only (control) or diets supplemented with 5%, 10% and 15% (w/w) FPH. The results show that dietary FPH levels significantly influenced the growth and immunity of the large yellow croaker. Compared with the control group, total weight gain (TWG) in all treatment groups, relative weight gain (RWG) and specific growth rate (SGR) in fish fed with diets supplemented with 10% and 15% FPH were significantly increased (P<0.05). Similar results were observed in immune parameters [lysozyme activity, serum complements, immunoglobulin M (IgM)]. Lysozyme activity, complement C4 and IgM were also significantly increased (P<0.05) in fish fed with diets supplemented with 10% and 15% FPH, while complement C3 level was significantly increased (P<0.05) in all treatment groups. In general, with the supplementation of FPH, particularly at dose of 10%, the growth performance and immunity of the large yellow croaker can be improved effectively.     

尼罗罗非鱼IgT重链的蛋白表达及表达分析

IgT（Immunoglobulin T）作为新型免疫球蛋白在粘膜免疫中具有重要作用. 文中根据尼罗罗非鱼IgT基因序列构建原核表达载体获得IgT重组蛋白，相对分子量约75 kDa，并制备出效价较高的小鼠抗罗非鱼IgT的多克隆抗体. 荧光定量PCR检测证明:健康尼罗罗非鱼中IgT在多种组织中都有表达，其中脾脏、皮肤、肠和鳃中表达量相对较高. 无乳链球菌感染后，皮肤和头肾中IgT mRNA的相对表达量分别在12 h和4 d显著上调. 免疫组化结果显示:IgT蛋白在头肾和皮肤中均有少量分布，在无乳链球菌刺激后，在皮肤中出现大量分布. 以上结果表明:IgT在尼罗罗非鱼皮肤粘膜免疫中具有重要作用.