牛病毒性腹泻病毒GSTZ株E1基因原核表达载体的构建及表达

为研究牛病毒性腹泻病毒的囊膜糖蛋白E1的抗原性,参考了Oregon C24V BVDV毒株的基因组序列(AF091605.1),并设计一对特异引物(上游引物5’-CCC GGA TCC ATG GCC TCT CCC TAC TGT-3’,下游引物5’-GGG CTC GAG TTA CCC TTG TGC TCC TGT T-3’),利用RT-PCR从病毒基因组中扩增E1基因609 bp全长片段,测序结果表明,与C24V株核苷酸同源性达100%.扩增产物经BamHI和XhoI双酶切,亚克隆至原核表达载体,双酶切鉴定表明成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-E1.重组表达载体转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot检测,成功诱导表达出25ku E1蛋白.实验结果为进一步研究BVDVE1蛋白的功能提供了参考.     

拟南芥HIS1-3基因克隆及表达载体构建

文章提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR扩增出HIS1-3基因的cDNA片段,连接到pEASY-T1Simple载体上,转化到Trans1-T1感受态细胞内,筛选阳性单克隆并抽提质粒。利用限制性内切酶Eco91Ⅰ和NcoⅠ对质粒pEASY-T1-HIS1-3和植物表达载体pCAMBIA2301进行完全双酶切,通过电转化法,将重组表达载体pCAMBIA2301-HIS1-3导入根癌农杆菌C58中以期获得携带HIS1-3基因的根瘤农杆菌株,为研究HIS1-3基因的抗逆分子机理以及遗传改良作物抗逆性奠定了基础。     

水稻OsAAA1蛋白的原核表达载体构建及其可溶性表达研究

为使用外源表达载体表达并纯化有活性的水稻ATP酶蛋白Os AAA1,构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并进行体外IPTG诱导表达和Ni+柱亲和层析纯化.利用SDS-PAGE和Western Blot检测了目的蛋白.结果表明:将成功构建的p ET-32a-Os AAA1原核表达载体,转化到大肠杆菌Origami菌株后,在70~100 KD之间检测到可溶性目的蛋白带,并优化了诱导表达的较适温度、IPTG诱导浓度和诱导表达时间.故成功构建了p ET-32a-Os AAA1原核表达载体并获得了可溶性Os AAA1目的蛋白,为其后续研究奠定了基础.     

温控表达载体的构建及HIV—1 p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐＢＶ２２０和ｐＥＴ２８，构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐＶＶ５，记载体携带ＰｒＰｌ串联温控启动子以及Ｈｉｓ－Ｔａｇ的纯化标签、利于目的蛋白的表达与纯化。将ＨＩＶ－ ｌｇａｇ基因的１１４８－１８５７编码序列分别插入到ｐＶＶ５ｂ，ｐＥＴ２８ｂ的相应位点，构建了重组表达质粒ｐＥＧ１ｂ，ｐＢＧ７ｂ，二者在不同受体菌中，表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的４２％和２８％。     

大黄鱼trim38基因的克隆及其表达分析

］由变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）引起的大黄鱼（Larimichthys crocea）内脏白点病的死亡率可达50%~80%。对抗病相关基因trim38进行了分子及表达特征等分析。结果显示:该基因开放阅读框（ORF）1623 bp,编码540个氨基酸,预测蛋白分子量为61.58 ku,等电点6.99。qRT-PCR的结果表明,在所有检测的组织中都发现了trim38的转录产物,但在肾脏中的相对表达量最高。变形假单胞菌攻毒刺激后,大黄鱼脾脏中该基因持续表达,在120 h达到峰值;肝脏中3 h显著表达,之后相对表达量降低;肾脏中该基因相对表达量变化不大,在96 h左右达到最大值。上述结果表明trim38基因参与了大黄鱼应对变形假单胞菌感染的抗病免疫过程。     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

单链莫奈林基因表达载体的构建及其分泌表达

根据甜蛋白莫奈林的氨基酸序列，选择酵母偏爱密码子，化学合成单链莫奈林(Single-Chain Monellin，SCM)基因片段，并拼接成全基因．基因的DNA序列分析表明，合成的单链莫奈林基因与设计的一致．该基因插入于毕赤氏酵母整合型质粒pPIC9K中置于AOXI启动子的控制下，并通过电转化技术将重组质粒pPIC9K／SCM导入Pichia pastoris，在含有G418的YEPD平板上筛选整合型的多拷贝的转化子．转化子在BMMY培养基中经甲醇诱导表达，用SDS-PAGE检测发酵液，表明SCM的分泌表达蛋白可达发酵液蛋白含量的90％．     

中介蝮Asn49-PLA2基因原核表达载体的构建及初步表达

以来自中介蝮(G.intermedius)毒腺cDNA文库的3个新Asn49-PLA2基因(GI4-PLA2,GIs-PLA2及其突变体G15'-PLA2)为模板,用PCR及DNA重组技术,将三个PLA2基因克隆到原核表达载体pQE-30,并在宿主茵E.coli Rosseta(DE3)中进行诱导表达.Bam H Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切及测序结果提示,成功构建了3个原核表达栽体(pQE-30/GI4-PLA2,pQE-30/GI5-PLA2,pQE-30/GI2'-PLA2).SDS-PAGE结果表明,中介蝮的3个Asn49-PLA2基因在大肠杆茵中实现表达,而且在37℃、1mM IPTG的诱导条件下,GI4-PLA2和GI5-PLA2的最佳表达时间为25h,而GI5'-PLA2在15h有较高水平的表达.     

脱水蛋白DHN1表达载体pBV221-dhn1的构建及基因表达

以克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )为基础 ,构建脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.采用PCR技术从克隆载体 pTZ 19R dhn1(ZM )上扩增dhn1片段 ,并引入NcoⅠ /BamHⅠ酶切位点 ,然后与 pBV2 2 1原核表达载体连接 ,得到 pBV2 2 1 dhn1表达载体 .阳性克隆经PCR和NcoⅠ /BamHⅠ酶切检测都得到 516bp的dhn1片段 ,且序列正确 .表达载体pBV2 2 1 dhn1转化宿主菌后能够表达产生相对分子质量为 2 2× 10 3的DHN1,该蛋白具有高温可溶性 .以上结果表明 ,本实验得到了高效表达的脱水蛋白DHN1表达载体 pBV2 2 1 dhn1.     

大黄鱼体重和内脏指标的相关性分析

为研究大黄鱼主要内脏指标差异及其与体重的相关性,随机取500尾养殖大黄鱼（雌鱼262尾,雄鱼238尾）,分别测定体重、肠长和5个主要m(脏器),计算脏器指数（I）。结果显示:除I（心脏）外,大黄鱼各m(脏器)和I（脏器）在雌雄间均有显著性差异（P<0.05）;大黄鱼部分m(脏器)之间和I（脏器）之间达到显著性相关;除I（性腺）和I（肠长）外,余m（脏器）和I（脏器）均与体重和m（胴体)呈极显著相关（P <0.01）;大黄鱼的m(心脏)、m(肝脏)、m(鳔)、m(胃肠)及肠长随鱼体增大而增加。多元回归分析显示m(脏器)与体重有显著相关性,其中m(鳔)与体重的相关性最强。     

大黄鱼Ghrelin基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR、RACE等技术,从大黄鱼胃组织中克隆得出Ghrelin基因的cDNA(649 bp),其中包含5'非翻译区(5'UTR),起始密码子,信号肽、成熟肽、C-端肽序列的编码区,终止密码子,3'非翻译区(3'UTR)和相对较少见的多核苷酸化信号(ATTAAA).获得的cDNA编码108个氨基酸,与已报道的硬骨鱼类Grelin mRNA比对显示,相似性(Similarity)和一致性(Identity)最高(黑鲷 Acanthopagrus schlegelii)可达81%和73%,推测的成熟肽包含硬骨鱼Ghrelin的相同活性中心和修饰位点,证明是鱼类Ghrelin同源基因.     

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法,首次从大黄鱼中克隆到全长为2 023 bp的凝血酶原类似基因cDNA,编码为617个氨基酸,其中包括80 bp的5′末端非编码区及89 bp包含poly(A)尾的3′末端非编码区。预测1~15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较,发现其与红鳍东方鲀有73%同源性,而与哺乳动物的同源性为50%~65%。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达,但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调,这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。     

绿色荧光蛋白基因在大黄鱼体内的表达

以绿色荧光蛋白基因为报告基因，以pIRESnco为载体质粒，制备含有报告基因的质粒，以肌肉注射的方式导入大黄鱼体内，每隔一周用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因在鱼体不同部位的表达情况。结果表明，绿色荧光蛋白基因可以大黄鱼体内得到表达，表达时间高达28d以上。绿色荧光蛋白基因不仅可以在肌肉注射部都组织细胞得到表达，而且在其它部位的肌肉、肝脏、肾脏和心脏等组织中也有表达，但表达水平低于肌肉注射部位组织。     

大黄鱼与黄姑鱼杂交F_1及其双亲的核型分析

研究了大黄鱼与黄姑鱼正反交F1原肠早期胚胎细胞及其亲本头肾细胞的染色体核型,为深入剖析大黄鱼与黄姑鱼杂交后代的基因组构成提供了细胞遗传学证据.大黄鱼与黄姑鱼染色体组均含有48条端部着丝粒染色体,染色体组型公式均为2n=48 t,染色体臂数均为NF=48,组内染色体长度分布连续.两亲本物种间核型很相似,未找到鉴别两物种的细胞遗传标志.正反交F1原肠期胚胎细胞的染色体众数也均为48,均可较好地配为24对.结合前期AFLP分析结果可以推断,正反交胚胎细胞均同时含有一个大黄鱼染色体组和一个黄姑鱼染色体组.此外,杂交F1中的非整倍体比例与两亲本没有明显区别,初步表明杂交胚胎细胞未发生明显的染色体丢失.在黄姑鱼♀与大黄鱼♂杂交F1中出现4对非t-染色体,原因尚待查明.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)fAFLP方法的建立

以大黄鱼为材料,探索及优化了影响荧光标记AFLP(fAFLP)分析体系的主要因素.结果表明:内切酶EcoRⅠ与MseⅠ各0.35 U,双酶切350 ng大黄鱼基因组DNA,依次反应4 h可得最佳效果;T4DNA连接酶2.5 U,16℃过夜连接3μL酶切产物与接头时效果最佳;以1μL连接产物作底物,EcoRⅠ与MseⅠ预扩引物分别为0.3μmol/L与1.5μmol/L时预扩效果最佳;预扩产物稀释超过100倍作为选择性扩增的模板时致使某些样品的电泳条带缺失.使用该体系分析了一个野生大黄鱼群体的AFLP片段的多态水平,结果证明该方法简便有效,可用于群体遗传多态性分析.     

大黄鱼幼鱼对低盐度的耐受性研究

通过设置盐度的突变和渐变实验研究了大黄鱼幼鱼对低盐度的耐受性.结果表明:在盐度突变实验中,将大黄鱼幼鱼直接从海水（盐度27.2）移入盐度为3～24的水中,72 h内不会导致明显死亡;从海水移入盐度为2的水中,72 h的存活率可达72%;从海水移入盐度为1的水中,3 h后开始出现死亡,24 h内大部分死亡;从海水移入淡水中,6 h内全部死亡.在盐度渐变实验中,将大黄鱼幼鱼从海水直接移入盐度为6的水中后,再以不同的幅度降低盐度,在盐度高于3时,大黄鱼幼鱼的死亡率与相应盐度的突变实验相比无明显差异;在盐度低于2时,大黄鱼幼鱼的死亡率低于相应盐度的突变实验的结果.研究表明,大黄鱼幼鱼具有较高的低盐度耐受力