水分胁迫诱导表达的小麦基因的cDNA片段克隆和序列分析

以30％（-1.13 MPa）PEG-6000对小麦幼苗进行重度水分胁迫处理,利用mRNA差异显示技术分离了水分胁迫诱导表达的小麦基因dil（dehydration induced,dil）的cDNA片段。Northern blot分析表明,dil基因在水分胁迫10h后表达开始增强并随着水分胁迫时间的延长而增强,水分胁迫48h时其表达最强。对dil基因的cDNA片段进行了克隆和序列测定（211bp）。经查询,在GenBank中没有与dil同源的基因序列。     

CⅡTA反义RNA对HLAⅡ类分子表达的仰制作用

为研究ＭＨＣⅡ类基因转录活化因子（ＣⅡＴＡ）对人类白细胞抗原（ＨＬＡ）Ⅱ类分子表达的影响,用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｒａｊｉ细胞中克隆到Ｃ Ⅱ ＴＡ基因ｃＤＮＡ ５＇端片段,构建成ＣⅡＴＡ反义ＲＮＡ真核表达载体 ｐｃＤＮＡ－Ⅱ,基因转移 ＨＬＡ Ⅱ类分子诱导型表达的 ＨｅＬａ细胞．经 ＩＦＮ－γ诱导,发现稳定转染ｐｃＤＮＡ－Ⅱ的细胞中ＨＬＡ－ＤＲ,ＤＰ和ＤＱ的表达均较转ｐｃＤＮＡ３空载体的细胞有显著下降,而 ＨＬＡⅠ类分子的表达不受影响．实验证明 ＣⅡ ＴＡ反义 ＲＮＡ对 ＨＬＡ Ⅱ类分子表达具有显著的抑制作用,为进一步开展低免疫原性的细胞移植提供了依据．     

人肝组织中新的C2H2型锌指蛋白编码序列的批量分离与克隆

为了探讨人肝组织中Ｃ２Ｈ２型锌脂蛋白基因的分布数目以及克隆新的锌指蛋白基因,设计了简并ＰＣＲ引物,扩增基因组ＤＮＡ,以其中的２个扩增片段为探针筛选人肝ｃＤＮＡ文库,获得了近百个阳性克隆,对其中的２０个ｃＤＮＡ片段进行了末端测序和同源检索,证明了１５个为新的锌指基因片段。对其中的４个ｃＤＮＡ片段进行了组织表达谱分析,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示：Ｌ５－５为肝,胰脏高度表达;其余为广谱表达。     

缺铁诱导玉米根cDNA文库的构建及铁胁迫基因(fdr3)的筛选和鉴定

为了分离铁缺乏相关基因,构建了一个滴度为４．５ｘ１０~５ｐｆｕ／μｇ的λＺＡＰ表达型缺铁胁迫玉米根 ｃＤＮＡ文库．通过差异筛选得到 ６个阳性克隆．经 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ验证在缺铁条件下加强表达的有ｆｄｒ３（Ｆｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ－ｒｅｌａｔｅｄ） ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ。     

山羊 β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β－酪蛋白基因启动区５′端上游调控序列和外显子１,２及内含子１在内的乳腺表达载体,并与人血清白蛋白（ｈＡＬＢ）小基因（含全长ｃＤＮＡ序列及其内含子１）构建成融合基因,鼠尾静脉注射实验表明,该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达,应用显微注射方法交该融合基因导入小鼠受精卵,并将受精卵移植于假孕母鼠,共获得３３只Ｆ０代小鼠,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证实,有８只小鼠基因组中整合有ｈＡＬ     

CⅡTA反义RNA对HLAⅡ类分子表达的抑制作用

为研究ＭＨＣⅡ类基因转录活化因子对人类白细胞抗原Ⅱ类分子表达的影响,用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｒａｊｉ细胞中克隆到ＣⅡＴＡ基因ｃＤＮＡ５’端片段,构建成ＣⅡＴＡ反义ＲＮＡ真核表达载体ｐｃＤＮＡ－Ⅱ,基因转移ＨＬＡⅡ类分子诱导型表达的ＨｅＬａ细胞,ＩＦＮ－γ诱导,发现稳定转染ｐｃＤＮＡ－Ⅱ的细胞中ＨＬＡ－ＤＲ,ＤＰ和ＤＱ的表达均较转ｐｃＤＮＡ３空载体的细胞有显著下降,而ＨＬＡ Ｉ类分子的表达不受影响。实验     

一个猪免疫球蛋白 IgG H 链基因的克隆、序列分析及表达

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从猪脾脏中分离到于段１４２５ｂｐ的ＤＮＡ片段,该片段编码免疫球蛋白基因。经全序列分析证明此片段与前人报道的序列有较高同源性,其Ｃ区属于猪Ｉｇγ链基因亚类３。用ＥｃｏＲＩ和ＮｓｉＩ切点将该片段切焉插入ｐＥＴ－３ｂ（ＮＳＥＢ）（－＿中,表达出约５２ｋｕ的蛋白质,表达量约为２１％。     

Pfu酶基因的克隆、表达、纯化及长距离PCR的研究

用ＰＣＲ方法从Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ的总ＮＤＡ扩增出了含有Ｐｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌＡ基因的２．３ｋｂ片段,并将该基因克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体。用ＮｃｏＩ和ＸｈｏＩ对重组质粒ｐＴ－ｐｆｕ进行了酶切。并将ｐｆｕ ｐｏｌＡ基因捶 入表达载体ｐＥＴ－３ｄ－Ｘ。     

胡萝卜lea基因cDNA片段的克隆及其表达特性分析

在ＭＳ培养基中加入高浓度的蔗糖，可使胡萝卜体细胞胚的发育静止于子叶胚阶段，而当蔗糖浓度恢复到正常水平时，静止的体细胞胚便转入胚后发育。采用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，从调控状态的胡萝卜体细胞胚中获得ｌｅａ基因Ｄｃ３家族一个新成员的ｃＤＮＡ片段。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明，该基因在调控状态的胡萝卜体细胞胚中具有强表达活性；在解调控１２ｈ的胡萝卜体细胞胚中，表达活性明显降低；解调控２４ｈ之后，其表达活性则基     

耐旱植物厚叶旋蒴苣苔BDN1脱水素基因的克隆及表达特性分析

根据已知植物脱水素基因保守区域设计引物,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法从耐旱植物厚叶旋蒴苣苔的总ｃＤＮＡ中扩增出一个５００ｂｐ的与植物脱水素基因同源的序列。结合５’ＲＡＣＥ获得了植物脱水素基因家族一个新成员ＢＤＮ１的全长ｃＤＮＡ（１１４８ｂｐ）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,ＢＤＮ１基因在厚叶旋蒴苣苔基因组中以单拷贝形式存在,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明,该基因的表达受干旱,寒冷及ＡＢＡ的诱导。推测该基因与     

人类细胞因子信号传导抑制因子基因humSOCS-2的分离与克隆

采用国际ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ数据库同源筛选的策略,筛选到１个与小鼠细胞因子信号传导抑制因子基因ｍｍＳＯＣＳ－２高度同源的ＥＳＴ９ｇｂＡＡ１１５２３９）,在人胎盘ｃＤＮＡ分子库中步移获得一长１０１１ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,包含一个长５９４ｂｐ的开放阅读框,编码了１９８个氨基酸残基,经ＮＣＢＩ数据库检索是一个全新的基因。     

表达人类Bcl-2蛋白的L929细胞模型的建立与应用

将人类ｂｃｌ－２ ｃＤＮＡ以正向克隆于真核表达载体ｐＬＸＳＮ并转染于Ｌ９２９细胞,建立了稳定表达人类Ｂｃｌ－２蛋白的哺乳类细胞模型,利用模型细胞进行研究表明,Ｂｃｌ－２的表达对细胞的正常增殖与存活表型无明显影响,但能增加细胞对肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）和ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）两种致凋亡因素的抵抗能力。此研究丰富了ｂｃｌ－２基因调控细胞凋亡的资料,为深入探讨ｂｃｌ－２的作用机制及其与其     

链霉菌M1033同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株的构建

为实现有工业生产价值的葡萄糖异构酶双突变体酶ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）的稳定高效表达,在建立７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３原生质体转化条件的基础上,构建了含６００ｂｐ不完整ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）结构基因片段的插入型同源重组质粒ｐＸＷ,并通过同源重组模式整合到Ｍ１０３３的染色体上,实现了ＧＩ基因的破坏（ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）,获得了同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株。对同源重组片段的分     

人ε-珠蛋白基因5'旁侧调控元件与核基质蛋白相互作用

运用凝胶电泳阻抑法揭示了在活跃表达人ε－珠蛋白基因的Ｋ５６２细胞内存在一个红细胞专一的核基质蛋白（简称ε－ＮＭＰｋ）,它能专一地与正调控元件ε－ＰＨＥⅡ　ＤＮＡ（－４４６～－４１９ｂｐ）相结合,Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,ε－ＮＭＰｋ是由 ２个分子量约为４０ｋｕ的亚基所组成．还发现在 Ｋ５６２,ＨＥＬ和 Ｒａｊｉ细胞中都至少存在着１个核基质蛋白,它们能与ε－珠蛋白基因 ５’旁侧 ＤＮＡ序列内的沉默子 ＤＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｅｒ,－３９２～－１７７ｂｐ）相结合,它们的结合区带（ｂａｎｄ Ｋ与ｂａｎｄＨ／Ｒ）位置并不完全相同,推测在ＨＥＬ和Ｒａｊｉ细胞内可能共同存在着一个与沉默子ＤＮＡ专一结合的核基质蛋白．实验结果表明,核基质蛋白可能积极参与了人ε－珠蛋白基因时空表达的调控．     

水稻减数分裂相关基因OsDMC1的克隆

酵母ＤＭＣ１基因是一个在减数分裂前期 Ｉ表达的减数分裂特异基因,其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的．根据在酵母Ｄｍｃ１与拟南芥ＡｔＤｍｃ１中保守的氨基酸ｍｏｔｉｆｓ合成的简并性引物,以ｃＤＮＡ作模板,通过套式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）和ＲＡＣＥｓ克隆了水稻中酵母ＤＭＣ１的同源基因 ＯｓＤＭＣ１．ＯｓＤＭＣ１全长的 ｃＤＮＡ是 １３４８ ｂｐ,编码 ３４４个氨基酸组成的多肽（ＯｓＤｍｃ１）． ＯｓＤｍｃ１与 Ｄｍｃ１和ＡｔＤｍｃ１的氨基酸序列一致性分别是５１．８％和８１．７％．ＯｓＤＭＣ１在生殖器官中表达量较高,在根中有少量表达,而在叶和幼芽中不表达． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果表明水稻基因组中有两个拷贝的 ＯｓＤＭＣ１．     

与水稻光敏核不育性相关的cDNA片段的鉴定和染色体定位

对利用ｃＤＮＡ－ＲＡＰＤ技术获得的光敏核不育水稻可育和不育幼穗ｍＲＮＡ差异表达的ｃＤＮＡ片段进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交鉴定,获得１个与光敏核不育性相关的阳性片段ＲＰＧ４３。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及相应的ＲＡＰＤ分析表明,ＲＰＧ４３为单拷贝序列,是转录后的加工产物。序列分析表明,ＲＰＧ４３长度为７４４ｂｐ,其中第１２６～１８５的６０个碱基与人类１１号染色体的ｐａｃ ｐＤＪ３５６ｄ６ ＤＮＡ序列有７２％的     

棉纤维相关cDNA的克隆及其在4个纤维突变体中的结构变异

用ＲＴ－ＰＣＲ方法从陆地棉遗传标准系“ＴＭ－１”的纤维细胞ＲＮＡ中克隆了一种纤维细胞优势表达的ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ,记为ＴＭ－Ｅ６基因）,该基因不含内含子,可读框长为７７１ｂｐ,可编码２４６个氨基酸的多肽。从４个纤维突变体中分别克隆同源性基因,并与野生型“ＴＭ－１”的ＴＭ－Ｅ６基因进行了同源性分析,发现纤维突变体不但在基因结构而且在密码组成上有明显变异。在距转录起始位点的第２７９碱基对处有ＧＧＣＴＣ     

Wnt/Frizzled信号传导通路在肾癌细胞系的表达

对Ｗｎｔ５Ａ,Ｗｎｔ５Ａ受体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５（ｈＦｚ５）及其信号传导系统下游成分－致癌性β－连环蛋白（β－ｃａｔｅｎｉｎ）在肾癌细胞系ＧＲＣ－１中表达的变化进行了观察,并定量ＲＴ－ＰＣＲ结果表明ＧＲＣ－１细胞系中Ｗｎｔ５Ａ和ｈＦｚ５的ｍＲＮＡ水平明显高于正常肾细胞系,这一发现被原位杂交结果证实,进上步的研究发现β－连环蛋白的含量明显高于正常肾小管细胞（Ｐ〈０．０１）。应用持异性免疫细胞化学和ＳＳ     

水稻低分子量GTP结合蛋白基因osRACD的分离

应用改良的ｍＲＮＡ差别显示技术，从农垦５８Ｓ水稻中，获得了一条与光周期育性转换性状相关的差异表达片段ＲＤＰ－８，同源性比较表明，该片段与玉米低分子量ＧＴＰ结合蛋白基因之间存在着很的序列同源性，进一步应用ＲＤＰ－８片段为探针，筛选长日照光周期处理的水稻农垦５Ｎ幼穗ｃＤＮＡ文库，经ＤＮ序列分析和同源性比较证实，所得的阳性克隆含有水稻低分子量ＧＴＰ幼穗ｃＤＮＡ文库，经ＤＮＡ序列分析和同源性比较证实。所得     

利用SSH技术研究小鼠淋巴组织中与束缚应激相关的基因

利用差异表达基因克隆技术减数杂交法,筛选束缚应激诱导小鼠淋巴组织特异表达或高表达基因。获得了应激状态下差异表达的ｃＤＮＡ片段,克隆化后挑选克隆测序。狭窄杂交结果表明Ｌ３６和Ｌ７两个克隆为应激诱导特异高表达的ｃＤＮＡ片段。经ＧｅｎＢａｎｋ检索,Ｌ７克隆只有片段同源序列而无全长同源序列,提示可能来自新基因。用ｏｒｔｈｅｒｎ杂交估算Ｌ３６和Ｌ７的转录基因分别为８００和７００ｂｐ。