汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

腺病毒介导ERK-2基因在生长板软骨细胞中的表达

目的:构建ERK-2基因重组腺病毒载体,检测构建的腺病毒感染原代大鼠生长板软骨细胞的效率以及目的基因的表达。方法:将ERK-2 cDNA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染E.Col.i B J5183,将筛选、鉴定的重组腺病毒质粒线性化后转染HEK293细胞进行病毒颗粒的包装;流式细胞术检测不同感染复数(MO I)ERK-2重组腺病毒感染原代培养的大鼠肋生长板软骨细胞的效率,W estern b lot检测腺病毒感染的生长板软骨细胞中ERK-2蛋白的表达。结果:成功构建ERK-2重组腺病毒,MO I 50的腺病毒感染原代生长板软骨细胞的效率大于90%,感染的生长板软骨细胞中ERK-2表达显著增加。结论:构建的重组腺病毒可介导ERK-2基因在原代大鼠生长板软骨细胞中高表达。     

重组GATA4腺病毒的构建及心肌细胞感染

利用AdEasy腺病毒表达系统构建了GATA4基因过表达腺病毒.编码大鼠GATA4基因的目的片段克隆入pAdTrackcmv质粒,pAdTtrackcmv-GATA4穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转入含pAdEasy-1的BJ5183菌进行同源重组.pAdEsay-GATA4重组质粒经卡那霉素抗性筛选及PacⅠ酶切鉴定.pAdEsay-GATA4转入293A细胞进行包装,产生具有感染性的重组病毒.Ad-GATA4重组病毒感染HeLa及乳鼠心肌细胞,通过免疫印迹及实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测GATA4表达及促心肌肥大效应.Ad-GATA4重组病毒感染乳鼠心肌细胞后,诱导心肌细胞表面积明显增加,ANF表达明显增强.结果表明,Ad-GATA4腺病毒成功感染心肌细胞并诱导了大鼠心肌肥大表型的出现.     

牛磺酸干预对高糖培养H9c2心肌细胞的保护效应与机制

为研究与分析牛磺酸干预对高糖培养H9c2心肌细胞的保护效应及其具体机制。通过将复苏的H9c2心肌细胞传至3～4代,分为以下三组:(1)对照组(CN):葡萄糖浓度为5. 5 mmol/L;(2)高糖组(HG):葡萄糖浓度为25. 5 mmol/L;(3)牛磺酸干预组(TAU):HG组基础上,加终浓度为40 mmol/L的牛磺酸。48 h后收集细胞,采用Annexin-V/碘化丙啶(propidine iodide,PI)结合流式细胞仪检测心肌细胞凋亡发生情况,Western Blot检测丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的蛋白表达,放射免疫法检测TNF-α表达量,并采用相关试剂盒检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果显示:与CN组相比较,HG组H9c2心肌细胞经高糖培养48 h后细胞凋亡率增加(P 0. 001),细胞TNF-α、MDA显著水平升高(P 0. 001),SOD水平降低(P 0. 001),胞内磷酸化p38水平亦升高(P 0. 001);加入牛磺酸干预后,与HG组比较,TAU组细胞凋亡率减小(P 0. 01),细胞TNF-α、MDA及磷酸化p38蛋白水平明显降低(P 0. 05),SOD水平升高(P 0. 01)。可见牛磺酸能够减轻高糖刺激下H9c2心肌细胞的凋亡,其机制可能通过上调SOD水平,下调TNF-α、MDA水平,降低胞内p38磷酸化来实现对高糖细胞损伤的保护效应。     

稳定表达Cytoglobin的肝细胞株LO-2的建立及生长增殖的变化

目的:建立过表达细胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝细胞LO-2稳定株,初步探究CYGB对LO-2细胞生长增殖的影响.方法:采用PCR法扩增CYGB编码基因,并通过GATEWAY克隆技术构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、测序鉴定后,与包装质粒三质粒共转人肾上皮细胞(HEK293T),收集、浓缩含病毒上清,获得病毒颗粒;感染LO-2细胞并采用流式细胞分选技术筛选稳定细胞株,Western blot检测表达情况;使用CCK-8试剂盒检测过表达CYGB对LO-2细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测过表达CYGB对LO-2细胞凋亡的影响.结果:慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB双酶切鉴定以及基因序列比对鉴定均正确.三质粒共转HEK293T细胞后,荧光显微镜下观察大部分细胞出现绿色荧光;收集病毒颗粒并感染LO-2细胞后,经流式细胞分选技术筛选获得稳定表达CYGB的细胞,Western blot鉴定显示,LO-2稳定株组的CYGB表达条带明显,阴性对照组未出现条带.CCK-8法绘制的细胞生长曲线显示,稳定表达细胞组的细胞生长速率低于阴性对...     

腺病毒介导的DPP6过表达载体的构建及其在大鼠心肌细胞内表达的鉴定

目的:构建腺病毒介导的DPP6过表达载体并验证其在大鼠心肌细胞内的表达.方法:应用PCR技术扩增目的基因DPP6,经酶切、连接等反应将目的基因插入穿梭载体p Shuttle-CMV中,进而转化至含有Ad Easy质粒的大肠杆菌中,进行重组;所产生的腺病毒载体转染在HEK-293细胞中,进行腺病毒的包装、分泌和扩增,所得病毒感染大鼠心肌细胞,进行荧光及实时定量PCR(q PCR)鉴定.结果:DPP6过表达腺病毒载体构建成功,经HEK293细胞包装、扩增后,所得病毒可成功感染初生大鼠心肌细胞,观测到腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达,q PCR检测DPP6 mRNA表达明显升高.结论:成功构建了腺病毒介导的DPP6过表达载体,并在大鼠心肌细胞内成功表达,为进一步研究DPP6在心肌细胞内的功能奠定了基础.     

NADPH氧化酶在油酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡中的作用

本研究旨在探讨NADPH氧化酶活化在油酸诱导的H9c2心肌细胞损伤中的作用.以体外培养H9c2心肌细胞为研究对象,用不同浓度(200,400,800μmol/L)油酸刺激H9c2心肌细胞(24,48,72 h),采用MTT法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞内活性氧和凋亡指标;免疫印迹法检测细胞内Caspase 3,Bax,Bcl-2变化.结果表明,油酸刺激明显抑制细胞增殖、细胞内活性氧水平明显增加、Cleaved-caspase 3蛋白水平明显增加、Bcl-2/Bax蛋白水平明显降低;NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理明显改善油酸所致H9c2心肌细胞增殖抑制、活性氧增加和凋亡.本研究结果提示NADPH氧化酶活化参与油酸所致H9c2心肌细胞凋亡.     

c-fos启动子与GFP重组质粒的构建及在Pc12细胞中的表达

目的：构建c—fos启动子与GFP的重组质粒载体,并使其在体外培养哺乳动物pcl2细胞中表达．方法：Xba I、Hind Ⅲ双酶切含c—fos启动子的HF443质粒,纯化后与同样双酶切的绿色荧光蛋白基因连接;利用Lipofect AMINE 2000将重组质粒转染体外培养哺乳动物pcl2细胞．结果：加入Na^ 通道激活剂乌头碱后,转染后的pcl2细胞可发出较强的绿色荧光．结论：c—fos启动子与GFP重组质粒构建成功,并可用于哺乳动物活细胞c—fos基因的检测．     

腺病毒介导的TRF2 RNAi表达载体诱导MCF-7细胞凋亡的研究

选择针对人TRF2 mRNA的特异性siRNA靶序列,设计、合成其相应的双链DNA,并构建成表达siRNA-TRF2的重组腺病毒载体rAd-shRNA-TRF2,转染人乳腺癌MCF-7细胞,以Western印迹法检测MCF-7细胞TRF2蛋白表达、MTT比色法绘制MCF-7细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞凋亡情况.实验结果表明:重组腺病毒载体rAd-shRNA-TRF2构建成功,转染MCF-7细胞后可明显抑制TRF2基因的表达,并抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡.说明通过RNAi技术抑制TRF2基因表达,进而诱导肿瘤细胞凋亡可能用于肿瘤的基因治疗.     

hPNAS-4腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤作用

[摘要] 目的：构建携带人的凋亡相关新基因PNAS-4(hPNAS-4)的重组腺病毒,并观察其感染人肺癌A549细胞所引起的hPNAS-4过表达对体外肿瘤细胞凋亡的影响。方法：用RT-PCR从293A细胞中克隆hPNAS-4编码区cDNA,将其酶切后连接至pENTR11载体上,再通过pENTR11与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST之间的同源重组作用将hPNAS-4基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后经293细胞的包装扩增后得到携带hPNAS-4基因的重组腺病毒;将重组腺病毒体外感染人肺癌A549细胞;用RT-PCR检测感染细胞中hPNAS-4的过表达情况;通过MTT、流式细胞术及DNA Ladder分别检测感染细胞的增殖与凋亡情况。结果：从293A细胞中中克隆到hPNAS-4全长cDNA并成功构建腺病毒表达载体Ad-hPNAS-4,经测定其滴度为：2.4×108 pfu/ml,感染人肺癌A549细胞后：经RT-PCR测得其mRNA表达明显上调,MTT检测结果为细胞增殖受到明显抑制,流式细胞术测得细胞凋亡率明显升高,琼脂糖凝胶电泳显示其基因组DNA有明显的梯状条带（DNA ladder）;结论：hPNAS-4腺病毒载体感染人肺癌A549细胞后,发现hPNAS-4过表达对肿瘤细胞的生长有明显的抑制和诱导凋亡作用,为今后研究其分子机制以及hPNAS-4腺病毒载体应用于肿瘤动物实验和肿瘤基因治疗提供实验资料。     

弹性蛋白酶保护因子--Elafin结构基因腺病毒载体穿梭质粒的构建、鉴定及表达

构建能表达弹性蛋白酶保护因子———elafin基因腺病毒表达载体的穿梭质粒,为进一步包装能高效表达结构蛋白的腺病毒载体做准备.以含有elafin基因的真核质粒pEGFP-N1-Elafin为模板,PCR扩增elafin基因,PCR产物以SalⅠ、EcoRⅤ双酶切,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中CMV启动子下游SalⅠ与EcoRⅤ位点之间,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-Elafin,通过SalⅠ及EcoRⅤ双酶切、PCR及插入片段序列测定对该质粒进行鉴定,将pAdTrack-CMV-Elafin转染293细胞,以RT-PCR及Western-Blot检测其在293细胞中的瞬时表达.结果表明:双酶切、PCR及测序鉴定证实,pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒的插入片段为elafin基因,用pAdTrack-CMV-Elafin穿梭质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和Western-blotting表明其可在293细胞中瞬时表达.     

鸡腺病毒内蒙古分离株六邻体蛋白基因片段的合成和分子克隆

根据鸡１０型腺病毒以及人２、５、４０、４１型腺病毒、牛３型、鼠１型腺病毒六邻体蛋白基因序列，选择保守区，设计和合成一对引物，以鸡腺病毒内蒙古分离株基因组ＤＮＡ为模板，进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到预期大小的０．５５ｋｂＤＮＡ片段．将此ＤＮＡ片段克隆于ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ位点，筛选重组质粒，进行限制酶切分析和ＰＣＲ检测，得到含有六邻体蛋白基因片段的重组质粒，为进一步开展此病毒分子生物学研究和分子生物学诊断技术的建立创造了条件     

人源CPP32基因表达对酵母细胞生长的影响

为研究人源ＣＰＰ３２基因的表达对酵母细胞生长的影响,了解其所编码的蛋白质在分子进行过程中的功能特性,将不原ＣＰＰ３２基因克隆到表达载体ｐＧＢＴ９中,得到重组质粒并命名为ｐＧＢＴ９／ＣＰＰ,再将其和对照质粒ｐ（ＧＢＴ９）分别转化到ＣＧ１９４５和ＨＦ７ｃ酵母细胞中,一定时间测定培养物的ＯＤ６００值并做出生长曲线。结果表明：诱导真核细胞程序性死亡的人源ＣＰＰ３２基因对不同种的酵母细胞的作用不同;转化到宿     

抗棉铃虫组织蛋白酶B单克隆抗体的制备及鉴定

分别以棉铃虫组织表达的组织蛋白酶B和基因重组的大肠杆菌表达的组织蛋白酶B为抗原免疫BALB／c小鼠，选择血清抗体滴度高的免疫小鼠，取其脾细胞和Sp2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合．经ELISA法筛选阳性克隆和有限稀释法克隆细胞，共获得分泌抗组织蛋白酶B的单克隆抗体杂交瘤细胞3株，分别命名为9D5，100E2和100H6．以ELISA法和Western blotting法对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了特异性鉴定，其中9D5和100E2能够同时识别两种不同来源的组织蛋白酶B，而100H6只能识别基因重组的大肠杆菌表达的组织蛋白酶B．     

重组质粒pEgr-1-TRAIL辐射诱导乳腺癌细胞效应的实验研究

目的将具有辐射诱导表达特性的重组质粒p Egr-1-TRAIL转入乳腺癌MCF-7细胞中,诱导肿瘤杀伤基因TRAIL的表达,实现辐射和基因对MCF-7细胞的双重杀伤效应.方法用ELISA法检测不同剂量X射线诱导TRAIL表达的量效关系及2 Gy X射线照射后不同时间TRAIL的表达;用流式细胞仪检测不同处理组MCF-7细胞早期凋亡情况.结果不同剂量X射线照射转染p Egr-1-TRAIL重组质粒的乳腺癌细胞MCF-7,TRAIL表达量明显高于假照组(P0.001~0.05),其中5 Gy X射线照后表达量最高,TRAIL表达量为假照组的5.1倍.2 Gy X射线照射后4 h,TRAIL表达量明显升高(P0.05),并随时间延长逐渐增加,照射后32 h达峰值,表达量为照射前的4.6倍.MCF-7-p Egr-1-TRAIL/0 Gy组早期凋亡细胞百分数较MCF-7/0 Gy和MCF-7-p3.1Egr/0 Gy组明显增加(P0.01),随着照射剂量的增加,MCF-7-p Egr-1-TRAIL/5 Gy组细胞早期凋亡率与其他处理组比较均存在统计学意义(P0.001~0.05),MCF-7/0 Gy组细胞生长最快,而MCF-7-p Egr-1-TRAIL/8 Gy组细胞生长最慢.结论乳腺癌细胞转染p Egr-1-TRAIL重组表达质粒联合X射线照射能够增加MCF-7细胞凋亡,抑制其生长.     

表达鸡传染性支气管炎病毒SD/97/01株S1蛋白的重组杆状病毒的构建

采用BAC－TO－BAC杆状病毒表达载体体系构建了表达鸡传染性支管炎病毒（IBV）呼吸型毒株SD／97／01S1蛋白的重组杆病病毒，含SD／97／01株S1基因原重组质粒p MDSD9701S1用BamHI和SalI双酶切后，回收的片段并克琶杆病病毒转座载体pFASTBACHTa中多角体基因启动子的下游，筛选出重组转座质粒pFASTSD9701S1U并转化大肠杆菌DH10BAC后,获得重组穿梭质粒rBacmidSD9701S1，用重组穿俊质粒DNA转染昆虫Sf9细胞，获得了含SD／97／01S1基因的重组杆状病毒rAcSD9701S1，重组病毒感染Sf9细胞后，用SDS－PAGE、Westernblot和IFA对细胞表达产物进行检测和分析。结果表明：构建的重组杆状病毒能够在昆虫细胞中表达SD／97／01的S1蛋白，该蛋白具有天然蛋白的抗原性。     

HCV非结构区NS3-5B蛋白的真核表达载体构建及其在BHK-21细胞中的表达

通过PCR方法扩增出HCV NS3-5b全长基因序列,克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b。利用脂质体将该质粒转染至BHK-21细胞,通过荧光成像和Western Blot检测NS3-5b基因的表达。结果显示成功构建了真核表达质粒pIRES2-EGFP-NS3-5b,并且NS3/4A蛋白和NS5B蛋白得到特异性表达,为下一步建立HCV RdRp活性的细胞评价系统和动物模型评价系统奠定了实验和理论基础。