羊种布鲁氏菌M5—90 omp31蛋白原核表达

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5—90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS—T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆人大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS—PAGE,而后Western—blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP3I基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99．03％;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western—blot检测到。结论：表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。     

H5N1亚型禽流感病毒M2的修饰表达及其免疫原性分析

禽流感的发生不仅会造成禽类的大量死亡,而且也严重地威胁着人类健康,接种疫苗是控制禽流感发生的主要措施之一.M2基因的保守性使其成为基因工程亚单位疫苗的目标抗原.本研究将M2基因的跨膜区删除后,构建原核表达载体pET32a-△M2,IPTG诱导后,收获的细菌总蛋白SDS-PAGE电泳结果表明修饰的M2基因在原核表达系统中得到高效表达,表达蛋白以可溶性形式存在,Western杂交和动物免疫结果表明重组蛋白具有抗原性和免疫原性.本研究结果为利用M2重组蛋白开发具有交叉保护作用的禽流感疫苗奠定了基础.     

鸡致病性E.coli O_(24)基因工程包涵体疫苗的制备及免疫原性

利用已构建的基因工程菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分别可见表达的20ku和40.9ku的特异条带,确定蛋白以包涵体的形式存在.Western blot结果表明,表达的Ⅰ型菌毛蛋白(pilA基因编码)和外膜蛋白(ompC基因编码)可与抗体发生特异性结合,说明其具有良好的反应原性.将表达特异蛋白的重组菌株BL21/pET-28a-pilA和BL21/pET-28a-ompC分别制成基因工程包涵体疫苗,免疫小鼠后,具有很好的保护能力.ELISA结果显示,免疫的小鼠体内已产生相应的抗体,效价为1∶400,说明这2种疫苗有很好的免疫原性.表明这2株基因工程菌株有望作为鸡致病性大肠杆菌基因工程疫苗的候选生产菌株.     

Rv3129的构建、表达、纯化以及免疫原性分析

目的 以结核分枝杆菌休眠期相关蛋白Rv3129作为研究对象,构建其重组质粒并进行原核表达,并通过体外人群实验、体内动物实验验证其免疫原性。方法 构建、表达并验证Rv3129蛋白,通过人外周血刺激释放实验、小鼠血清抗体水平检测以及各细胞因子检测实验验证该疫苗的免疫原性。结果 成功构建、表达及纯化rRv3129,可刺激M.tb感染人群外周血能够有效分泌高水平IFN-γ。动物实验中,初免增强策略下的亚单位疫苗Rv3129/DIM能够诱导强烈的Th1型免疫应答,分泌的抗体水平显著高于其他组别。结论 该亚单位疫苗具有较强的免疫原性,能够在机体内诱导强烈的Th1型免疫反应,对预防成人结核病可能具有重要意义。     

AN融合抗原制备及其加强BCG免疫效果的研究

亚单位疫苗研究中抗原的选择对疫苗效果至关重要.本研究选取结核分枝杆菌中ESX-Ⅰ～ESX-Ⅴ分泌系统的同源蛋白EsxA,EsxC,EsxE,EsxT,EsxN构建融合蛋白AN,通过序列分析、实验动物模型评估其作为亚单位疫苗的可行性.AN抗原的一级结构中存在332个T细胞受体强结合位点,说明融合抗原AN能够提供更多的T细胞识别表位.纯化后的AN抗原免疫C57BL/6小鼠,分离小鼠脾细胞进行胞内因子染色(ICS),结果证明AN抗原能激起高于或接近Ag85A的Th1型细胞因子分泌,具有较强的免疫原性,可以作为构建亚单位疫苗的候选抗原.利用BALB/c小鼠模型评估AN对于BCG免疫的加强保护效应,发现单次AN加强免疫,可使小鼠脾脏细菌清除率增加70.2%,增强了重组BCG的保护效果.     

重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫

将动物生长抑素(SS)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合基因插入p ET28a系统,构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)p ET28a-A4030-2-LTB,然后使用SDS-PAGE检测该融合蛋白的表达并优化其发酵与包涵体洗涤条件,接着采用亲和层析法进行纯化,并用Western Blotting技术检测该融合蛋白的免疫原性.研究结果表明,在37℃,加入1 mmol/L的IPTG培养3 h后,融合蛋白的表达量最高且稳定表达;在包涵体洗涤的过程中,使用含有φ=1%的Triton X-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体沉淀,其效果最佳,用Western Blotting方法检测出该蛋白能发生抗原抗体反应,并且将重组蛋白免疫7只小鼠后,其中有6只小鼠产生了抗SS抗体,表达产物具有免疫原性.此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.     

重组百日咳杆菌粘附素C端蛋白的免疫原性

分别将支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌粘附素(PRN)基因prn的全长编码区2 040 bp及3'端867 bp的片段(prnC)克隆到原核表达载体pGEX-KG,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达.Western blot检测证实两种表达产物GST-PC和GST-PRN均具有良好的免疫学反应活性.在主动免疫保护试验中,GST-PC和GST-PRN免疫组小鼠均能产生较高的PRN抗体水平;当使用3 LD50的Bb强毒株HH0809进行鼻腔攻毒后,其保护率均为100% (9/9);当使用10 LD50 HH0809攻毒时,其保护率分别为66.7% (6/9)和77.8% (7/9).在被动免疫保护试验中,腹腔免疫GST-PC和GST-PRN的兔抗血清均能100% (10/10)保护小鼠抵抗10 LD50的HH0809的腹腔攻击,但经PRN吸附后的2种兔抗血清均失去了保护力(0/5).研究结果表明:重组PRN C端多肽具有良好的免疫原性,可考虑作为新型亚单位疫苗或活载体疫苗的抗原成分.     

致病性大肠埃希菌毒力因子致病性及研究进展

EPEC和ETEC是引起幼畜腹泻的主要致病菌,每年给全球养殖业带来了巨大的经济损失,因此理解EPEC、ETEC的毒力因子与致病性的关系具有极为重要实际意义.本文对EPEC和ETEC两种病原菌中毒力因子的致病机理、免疫原性以及它们的研究进展进行了概述,为进行深入研究大肠杆菌毒力因子、防止大肠杆菌病以及研制高效的大肠杆菌病疫苗提供理论依据.     

DNA疫苗在动物医学中的应用

DNA疫苗是继减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗之后的又一新型疫苗,比其它疫苗高效、安全且易于大量生产。本文对DNA疫苗在牛、猪和鸡一些病毒病上的使用效果及其安全问题等方面的研究近况作一综述。     

中华鳖抗嗜水气单胞菌亚单位疫苗的制备与应用

水体条件致病菌嗜水气单胞菌对中华鳖养殖业的危害巨大.为预防嗜水气单胞菌的感染,提高中华鳖免疫抵抗力,研究开发嗜水气单胞菌疫苗是一种有效的方法.利用PCR手段克隆获得嗜水气单胞菌DnaK和DnaJ两个基因,并将两基因重组到大肠杆菌表达载体上,转化至大肠杆菌表达菌株,纯化获得了重组蛋白rDnaKAh和rDnaJAh.将两个重组蛋白分别与弗氏佐剂充分混合制备成疫苗,腹腔注射中华鳖幼鳖,加强免疫一次后,用已分离获得的致病菌株感染中华鳖幼鳖,实验结果表明rDnaK具有81.8％的免疫保护效应,而rDnaJ仅具有31.8％的免疫保护效应.     

Conservation of the D-mannose-adhesion protein among type 1 fimbriated members of the family Enterobacteriaceae

A variety of genera and species of the family Enterobacteriaceae bear surface fimbriae that enable them to bind to D-mannose residues on eukaryotic cells. Until recently, it was thought that the D-mannose binding site was located in the major structural subunit (FimA), of relative molecular mass (Mr) 17,000 (17 K), of these organelles in Escherichia coli. New evidence indicates that this binding site resides instead in a minor protein Mr 28-31 K (FimH) located at the tips and at long intervals along the length of the fimbriae, and is reminiscent of the minor tip adhesion proteins of pyelonephritis-associated pili (Pap) and S fimbriae. In contrast to the antigenic heterogeneity of the major FimA subunit, the antigenic structure of FimH is conserved among different strains of E. coli. Here, we report an even broader conservation of this minor adhesion protein extending to other genera and species of type 1 fimbriated Enterobacteriaceae. Our results may have implications for the development of broadly protective vaccines against Gram-negative bacillary infections in animals and perhaps in man.     

长型肌球蛋白轻链激酶4Ig结构域的表达及单克隆抗体的制备

长型肌球蛋白轻链激酶(long myosin light chain kinase,L-MLCK)及其分子内结构域的功能还不清楚.在研究其功能时,特异性抗体是一基本工具,但目前国际上还没有制备成功特异性较好的抗体.为此,我们先在大肠杆菌E.coliBL21中重组表达了鸡L-MLCK的4Ig蛋白片段(MLCK4Ig),蛋白经纯化后作为抗原免疫小鼠.在小鼠血清中检测到特异性抗体的基础上,建立了2株杂交瘤细胞株,获得抗鸡MLCK4Ig的单克隆抗体.该抗体可以特异与鸡L-MLCK和鸡MLCK4Ig反应.本文并对该抗体的特性及应用进行了讨论.结果表明,我们部分解决了L-MLCK的抗体缺乏问题,为研究L-MLCK及MLCK4Ig片段的功能提供了重要工具.     

转移RNA结构基因共有序列的统计分析

本文以大肠杆菌、地钱叶绿体和鸡线粒体基因组中:RNA结构基因的全部拷贝数为分析总体,统计出了碱基分布。在大肠杆菌中证实了Pu52-Py62半不变核苷酸对,排除了A21的共有性,确认了24个共有核苷酸,其中半数核苷酸参加三级氢键的形成作用;螺旋区碱基标准配对率平均为95％;在非标准配对中以GU为主而且集中在两个连续双螺旋的缺口处,又发现在第10、27、49位G居多现象,其意义有待阐明。大肠杆菌tRNA序列与地钱叶绿体tRNA序列极为相似,鸡线粒体tRNA由于缺乏典型的D环和TψC环而与大肠杆菌tRNA序列差别较大。本文还计算了大肠杆菌tRNA基因拷贝数与密码子利用率之间相关系数(r=0.976),并讨论了影响细胞内tRNA含量的基因剂量效应,位置效应诸问题。     

哈维氏弧菌TS-628菌株抗原性研究

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水鱼虾养殖中常见的致病菌,由该菌引发的病害给世界各地的养殖业带来重大经济损失,但对其有效抗原的筛选或相关疫苗的研究报道相当少,对其病害的防治也尚无有效措施.本文以患病青石斑鱼分离到的病原菌哈维氏弧菌TS-628菌株为研究对象,分别提取它的鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)和外膜蛋白(OMP),并采用Western blot技术分析检测这3种成分的抗原性.结果显示,鞭毛蛋白主要的免疫印迹带约有4条,其中43、52 ku为主要免疫反应显色带;OMP主要的免疫印迹带约有5条,其中43 ku为最主要免疫反应显色带, 35、38、47和52 ku也具有较强的免疫显色反应.LPS没有检测到免疫印迹反应.这一研究结果将为灵敏检测哈维氏弧菌以及研制高效疫苗奠定基础.     

Improved immunogenicity of a peptide epitope after fusion to hepatitis B core protein

Synthetic vaccines for viral diseases can use defined regions of viral proteins as immunogens: the peptide sequence of amino acids 141-160 of the VP1 protein of foot and mouth disease virus (FMDV) elicits virus-neutralizing antibodies to protect guinea pigs, cattle and pigs either when coupled to a carrier protein or when administered in liposomes or in incomplete Freund's adjuvant. The immune response to these peptides is much lower than that to complete virus particles and the same sequence fused to the N terminus of beta-galactosidase did not produce a more potent immunogen than synthetic peptide alone. We report here an expression system for immunogenic epitopes linked to a carrier protein, hepatitis B core antigen, to form part of a virus-like complex which can present these epitopes to the immune system at high density. The immunogenicity of these structures approaches that of FMDV particles.     

鸡缩胆囊素-33四串体的可溶表达及应用研究

根据pRSETA载体序列,设计一对引物,采用PCR技术从重组质粒pRSETA-4CCK33上扩增到鸡缩胆囊素33(cholecystokinin-33,CCK33)四串体基因片段(缩写为4CCK33)。再将4CCK33克隆到原核表达载体pBCX上,成功构建重组质粒pBCX-4CCK33并在大肠杆菌BL21中成功表达,SDS-PAGE检测到分子量约为53 000的融合蛋白,可溶分析表明,融合蛋白主要是以可溶形式表达。Western-blot证实,融合蛋白能与CCK-8阳性血清发生免疫反应。用此纯化的融合蛋白制成油乳剂疫苗,主动免疫肉猪。饲养试验表明,免疫0.5 mg/mL和1.5 mg/mL 4CCK33疫苗的试验肉猪平均日增重与空白对照组相比,分别提高了5.28%和5.92%;日采食量则分别提高3.03%和2.53%,差异显著(P<0.05)。     

An immunologically active chimaeric protein containing herpes simplex virus type 1 glycoprotein D

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-2) cause both persistent and latent infections, including recurrent cutaneous disease, lethal neonatal disease, central nervous system disease and other clinical syndromes. Modified live vaccines or conventionally prepared subunit vaccines have generally been unsuccessful in the treatment of HSV-1 and HSV-2 infections from the standpoints of safety and efficacy. It has been established that HSV-1 and HSV-2 infectivity may be neutralized in vitro with antisera directed specifically against each of the four major glycoproteins of the virus (gA/gB, gC, gD and gE) and antisera against glycoprotein gD, of either HSV-1 or HSV-2, are capable of neutralizing both HSV-1 and HSV-2 infectivity in vitro and in vivo. We have previously reported on the identification, DNA sequence and expression at low level in Escherichia coli of the gD gene of HSV-1 strain Patton. Here we describe construction of a hybrid gene encoding a chimaeric protein containing HSV-1 gD, bacteriophage lambda Cro and E. coli beta-galactosidase (gD-beta-gal) protein, which is expressed at high level in E. coli. Moreover, the chimaeric protein elicits antibodies in rabbits that not only immunoprecipitate gD from cells infected with HSV-1 and HSV-2 but also neutralize HSV-1 and HSV-2 infectivity in vitro.     

内蒙古部分地区肉仔鸡致病性大肠杆菌生物学特性的研究

从内蒙古四个盟市分离到10种优势血清型的肉仔鸡致病性E.coli,对其进行生物学特性研究表明：电镜观察均具有菌毛，形态不完全一致；有的还可见到有鞭毛生长。均无溶血性，对1%、3%、5%鸡红细胞悬液均可产生明显的凝集作用(+++～++++)，加入甘露糖后，E.coliO1、O35、O54、O55、O103、O68表现为“+”凝集作用，而O5、O20、O2、O78则表现为抑制作用。所有血清型盐凝集阳性(SAT+)，并且都能摄入刚果红染料。     

中药免疫增强剂研究进展

中药免疫增强剂能非特异性地与抗原结合而增强其特异性免疫原性,调节、增强、恢复机体免疫功能,增强机体免疫应答或改变免疫应答类型,是治疗和预防疾病的重要物质,特别是对疫苗发挥作用具有独特的效果。详细论述了中药免疫增强剂的种类、有效成分及影响其作用功能的因素等。     

LTB的表达及其粘膜免疫佐剂活性分析

粘膜免疫是预防一些通过吸附粘膜组织侵入机体病原的很好措施,但粘膜免疫通常需要粘膜免疫佐剂,大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素的B亚基具有很好的粘膜免疫佐剂活性.本研究从大肠杆菌195菌株中扩增出LT(heat-labile enterotoxin)基因,测序后将其B亚基基因与pET32a连接构建了重组质粒pET32a-LTB,SDS-PAGE显示LTB(heat-labile enterotoxin B subunit)在原核细胞中得到表达,Western blotting和人神经节苷脂结合酶联免疫吸附试验(GM1-ELISA)结果表明,重组LTB具有抗原性和GM1结合活性.将其与禽流感M2e表位融合蛋白M2eHBc+混合通过滴鼻途径免疫小鼠,抗体检测结果表明,所表达的LTB能很好地提高共免疫抗原的粘膜和系统免疫应答.