脊髓灰质炎病毒琼脂弥散沉淀反应的研究

琼脂弥散沉淀试验曾用于流行性感昌病毒、痘类病毒、脊髓灰质炎病毒(以下简称灰质炎病毒)、腺病毒和某些肠道病毒的研究。本文报告我们对灰质炎病毒的沉淀抗原的制备、试验的技术方法及強毒株和減毒株的抗原性进行研究的结果。材料和方法一、病毒株所用病毒株包括Ⅰ型(Mahoney)、Ⅱ型(MEF_2)和Ⅲ型(Saukett)灰质炎病毒原型株及Ⅰ型(L.Sc.2ab)、Ⅱ型     

1994年北京急性出血性结膜炎病毒的分离与鉴定

急性出血性结膜炎(AHC)可象流感样反复流行或大流行,自1971年传入我国以来曾多次在许多地区发生流行。1988年的流行人们还记忆犹新,1994年又再次发生流行。引起AHC病毒主要为肠道病毒70型(EV70)和柯萨奇病毒A24型变异株(CA24V)。在每次流行时进行病原学研究和对分离毒株作抗原分析,对于探讨本病反复流行的原因及疫情的预测、预报有重要意义。     

艾伯特·B·萨宾(1906—1993)

自从兰斯坦(Lansteiner)和波普(Pooer)在1908年成功地从猴子体内分离出脊髓灰质炎病毒后,便开创了脊髓灰质研究的光辉历程,至50年代由于研制出使用疫苗来预防该病的发生而使该领域的研究达到了顶峰时期。今年3月3日在华盛顿去世的艾伯特·B·萨宾(Albert·B·Sabin)是这一研究领域的成功者之一。萨宾对脊髓灰质炎的兴趣据讲是在1931年的纽约脊髓灰质炎的流行病学调查工作期间培养起来的,同年他毕业于纽约大学     

Vero细胞培养传代后的2株SARS冠状病毒基因组序列变异分析

RNA病毒在复制时有易出错的倾向, 因此SARS病毒在传染或传代过程中易发生突变而产生不同的毒株, 这种机制也利于病毒逃脱宿主的免疫系统而生存下来. 许多研究也表明, 不同的SARS病毒分离株的全基因组序列存在不同程度的差异, 这些差异的研究无疑对SARS病毒疫苗的研制具有重要的指导意义. 同时, 对SARS病毒在传代过程中的遗传稳定性及核酸特性的分析, 是SARS疫苗研制不可或缺的环节. 采用PCR产物直接测序的方法, 对2株用Vero细胞培养经过多次传代的SARS病毒进行了全基因组序列的测定, 通过比较分析发现该病毒在传代过程中具有高遗传稳定性, 其中检定参比株(Sino1株)2和11代全基因组序列比较有4个碱基的变化, 而候选疫苗株(Sino3株)3与10代的基因组全序列仅有1个碱基的差异. SARS病毒在Vero细胞上传代的遗传稳定性表明, 以此制备的灭活病毒疫苗是稳定的.     

从克山病患者脏器分离的未定型病毒的电子显微镜研究

从一些急型与亚急型克山病患者的某些脏器分离到一些病毒株,并做过血清学初步研究.对其中一些未定型病毒株我们做了电子显微镜研究.从不同患者心肌、脾脏与血液分离的三个未定型毒株均观察到了病毒颗粒.病毒是在宿主细胞核内复制装配.毒粒的直径为35—37毫微米.虽然不能仅靠电镜观察最终确定病毒的分类地位,但本文的材料可以对分离的未定型病毒提出一些重要说明.同时对该病毒在细胞内的复制装配与核仁——染色质的关系提出一些有意义的观察结果.     

1970~2004年全球肠道病毒71型分离株的分子流行病学分析

人类肠道病毒71型（EV71）是引起手足口病的主要病原体，常导致严重的神经综合症。近年来病毒多爆发于亚太地区的热带区域。为了研究人类肠道病毒的进化历程以及遗传变异性，我们搜集了全球在1970年至2004年间分离的532株病毒的序列信息，这些信息包含了完整或接近完整的VP1片段序列(全为891个氨基酸)。经过两两序列比对以及遗传距离的分析，发现绝大多数病毒株属于先前分类的B或C型。同时，也观察到一种特殊的不属于任何分型的毒株R13223-IND-01，可能代表了一种新的病毒分型。在B型和C型病毒中，存在着一些区别于同型其他亚型的“孤儿株”，它们的出现在病毒进化分析中有重要的意义。此外，VP1片段上有6个位于离散位置的氨基酸存在共变异的现象，分析发现这种高比例的共变异与病毒亚型有着紧密的联系。     

由标准强毒F114株全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒

通过RT-PCR获得猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)强毒株cF114株(中国标准强毒F114株经PK-15细胞增殖)全长基因组cDNA并测序. 与已知其他几株CSFV代表毒株F114, Brescia, Alfort和C株的核苷酸同源性分别为99.41%, 96.80%, 86.03%和95.70%; 氨基酸同源性分别为99.28%, 98.54%, 93.33%和97.41%. 将获得的各基因片段按病毒基因组顺序连接成全长cDNA, 插入pMC18质粒SalⅠ/ XbaⅠ之间, 得到含病毒全长基因组的重组质粒pMC12297. 用T7 RNA聚合酶进行体外转录, 转录出的RNA转染PK-15细胞, 细胞上清液经扩增后, 测定上清液中病毒滴度. 质粒来源的CSFV(vM12297)在抗原反应性和复制能力方面与父代病毒相似. 将疫苗毒C株囊膜蛋白基因E01和E2分别替换到pMC12297相应位置, 获得嵌合体基因组质粒pM/CE01和pM/CE2, 体外恢复获得嵌合体病毒vM/CE01和vM/CE2. 两种嵌合体病毒均能感染PK-15, SK-6和原代猪睾丸细胞, 间接免疫荧光检测显示较vM12297弱, 在PK-15细胞上滴度达到8×10 F-PFU/mL. 这一工作为进一步研究和探讨CSFV增殖与致弱的机理提供了重要的实验和理论资料.     

逐步预测和统计学筛选人H_5N_1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H5N1毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位,检测了人禽流感H5N1毒株NA基因核苷酸序列.采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,并用SPSS13.0进行聚类和相关分析,建立了一种统计学筛选程序,预测了H5N1病毒NA蛋白的B细胞表位,并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析.预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价.结果发现,预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120～137,81～84,408～415,273～282,429～432,356～368,46～55,146～155,341～350,198～209肽段,提示它们是B细胞表位的优势区段;含有糖基化位点NGT126～128的120～137肽段为首选的NA蛋白抗原表位;H5N1毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失,这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性,而且抗原表位扩大(VEP46～48→VEPISNTNFL46～55).采用SWISS-MODEL软件建立的N1蛋白模型有助于...     

脊髓灰质炎后遗症期的恒河猴横纹肌细胞的电子显微镜观察

为了解脊髓灰质炎后遗症期横纹肌细胞的超微结构改变,本实验对实验性脊髓灰质炎后遗症期的恒河猴横纹肌细胞进行了电子显微镜观察. 实验动物为云南产的恒河猴,共2只,一只作为对照,另一只接种脊髓灰质炎病毒株Ⅱ型232,造成麻痹症,发病一年,渡入后遗症期后,再用于电镜观察.取实验动物的股直肌和腓肠肌,切成1mm~3左右小块,放入0.1M     

低毒力病毒CHV1 (Cryphonectria hypovirus 1)的水平传播受到病毒毒株的影响

观测到低毒力病毒CHV1在栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)菌株间的水平传播受病毒毒株的影响. 实验室条件下对3个CHV1低毒力病毒在栗疫病菌各营养体亲和群菌株间进行了重复传播实验, 量化分析了3个病毒在相差1~2个vic基因位点时传播效率的差异. 结果表明, 不同的CHV1低毒力病毒具有不同的水平传播能力, 发现并使用传播能力更高的低毒力病毒, 将会显著提高对栗疫病的生物防治效率.     

甲型流感病毒H7N9血凝素单克隆抗体的制备及保护性研究

以H7N9甲型流感病毒(A/Shanghai/2/2013)全病毒灭活疫苗原液为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗甲型流感病毒H7N9血凝素(HA)的单克隆抗体.通过ELISA和血凝抑制(HI)试验初步筛选单克隆抗体,筛选后的Ig G类单克隆抗体用中和试验检测其中和活性.将有中和活性的单抗通过小鼠体内法大量制备腹水,腹水经亲和层析柱纯化后进行特异性及稳定性检测.同时在小鼠模型中进行了HA单克隆抗体抵抗同源流感病毒感染的预防性和治疗性实验,通过观察小鼠的症状并统计小鼠的存活率、体重变化和肺部病毒滴度等指标发现单抗6A3在预防性和治疗性实验中都可以有效地抵抗H7N9流感病毒的感染.显著降低肺部病毒滴度,对小鼠提供100%的保护.甲型流感病毒H7N9血凝素单克隆抗体的成功制备为进一步研究H7N9流感病毒血凝素的抗原表位及治疗诊断试剂的开发奠定了基础.     

肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型变异株细胞受体的研究

肠道病毒70型(Ev70)和柯萨奇病毒A24型变异株(CA24v)是急性出血性结膜炎(AHC)的病原体,故称为AHC病毒。这两种病毒在临床上引起同一种疾病,人们猜测这两种病毒间必有某种关系。但免疫学研究表明这两种病     

伪狂犬病毒胸苷激酶基因变异引起的病毒致弱作用

为揭示PRV tk基因结构与毒力的相互关系,tk基因结构变异对病毒生物学特性的影响和探讨病毒的致弱机理,以伪狂犬病毒湖北株（PRV HB）为材料,用BUdB诱变选择,分离出BUdR抗性的PRV TK^-突变株。在对野毒株和TK^-突变株tk基因克隆和测序的基础上,分析比较了两种毒株tk基因的一级结构。测定的PRV HB野毒株tk基因片段长1587bp,GC含量为72．7％。包含一个1098bp的ORF。编码366个氨基酸残基组成的蛋白。ORF内有2个137bp核苷酸的重复序列,两者以一个A连接。测定的TK^-突变株tk基因片段长1458bp,野毒株中137bp重复序列之一和连接A被自然删除,另有一个8核苷酸（GCGCGCCC）重复片段的插入,其他所有核苷酸与野毒株一致。在TK^-突变株中因核苷酸片段的缺失和插入,tk基因发生移框突变,导致转译提前终止,不能产生有功能的TK蛋白。氨基酸序列分析显示,PRV HB TK具有疱疹病毒TK共有的保守功能区并多出一个保守的DRH功能位点。实验还证实,TK^-突变株具有生物学遗传稳定性。与野毒株比较,其毒力显著降低。用TK^-突变株种小鼠,能诱导小鼠产生针对PRV强毒株致死攻击的有效保护。     

RDD基序对口蹄疫Asia1型毒株感染力的影响

不同型口蹄疫病毒1D蛋白的βG和βH链之间都含有一个高度保守的RGD基序,其结合细胞受体,起始病毒感染.但本文通过对Asia1型FMDV的1D序列分析证实,田间毒株含有RGD和RDD基序(RGD中的G突变为D)的两种类型毒株.通过反向遗传技术制备了分别含有RGD和RDD基序的两种病毒,测定其生物学特性,并通过细胞感染力和乳鼠致病力比较这两种病毒感染力的差别.结果表明,含有RGD和RDD的毒株都具有感染性,含有RDD毒株的细胞感染力和乳鼠致病力比含RGD的高10倍左右,为进一步阐明RDD基序Asia1毒株的感染机制的分子基础奠定必要的基础.     

甲型H1N1流感病毒流行株基因组进化分析

2009年4月, 北美地区出现甲型H1N1流感疫情, 并且疫情快速扩散至欧亚非三大洲, 风险等级上升至5级. 截止至5月13日, 甲型H1N1流感病毒已扩散至33个国家和地区, 实验室确认病例5728例, 死亡61人. 从NCBI的IRV和GISAID的EpiFluDB数据库下载甲型H1N1流感病毒序列425条, 进行序列比对与进化分析. 分析结果显示: (ⅰ) 当前流行的甲型H1N1流感病毒是一个三重排A型流感病毒: HA, NA, MP, NP和NS来源于猪流感病毒; PB2和PA来源于禽流感病毒; PB1来源于人流感病毒. (ⅱ) 猪流感病毒的来源可细分为: HA, NP和NS来源于H1N1亚型经典猪流感毒株; NA和MP来源于H1N1亚型禽源猪流感毒株. (ⅲ) 甲型H1N1流感病毒在流行扩散过程中没有显著变异, 同时病毒基因组没有发生重排. 本文除了分析美国代表毒株A/California/04/2009(H1N1)外, 还以墨西哥代表毒株A/Mexico/4486/2009(H1N1)为主进行了同源性和进化分析, 地理范围相对较大, 分析结果更具科学性.     

逐步预测和统计学筛选人H5N1毒株神经氨酸酶蛋白B细胞表位

为了预测和筛选人禽流感H₅N₁毒株神经氨酸酶(NA)蛋白的B细胞表位, 检测了人禽流感H₅N₁毒株NA基因核苷酸序列. 采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案, 辅以对NA蛋白的二级结构中的柔性区域的分析, 并用SPSS 13.0进行聚类和相关分析, 建立了一种统计学筛选程序, 预测了H₅N₁病毒NA蛋白的B细胞表位, 并对毒株GD-01-06的NA蛋白变异进行了分析. 预测结果通过吴氏抗原指数和SWISS-MODEL软件进行评价. 结果发现, 预测并筛选最有可能的B细胞表位位于NA蛋白N端第120~137, 81~84, 408~415, 273~282, 429~432, 356~368, 46~55, 146~155, 341~350, 198~209肽段, 提示它们是B细胞表位的优势区段; 含有糖基化位点NGT_126~128的120~137肽段为首选的NA蛋白抗原表位; H₅N₁毒株NA蛋白第53位(Ⅰ)位点缺失, 这有助于增加毒株GD-01-06的NA蛋白表面柔性, 而且抗原表位扩大(VEP_46~48→VEPISNTNFL_46~55). 采用SWISS-MODEL软件建立的N₁蛋白模型有助于评价抗原表位预测. 结果表明, 用多参数预测以及用统计学筛选H₅N₁毒株NA蛋白的B细胞表位, 可以为分子免疫学研究和药物筛选提供依据; 广东GD-01-06毒株NA蛋白53位(Ⅰ)位点缺失可能增强该抗原表位的抗原性.     

控制麻疹病毒血凝集性的重要功能位点

IMA·SMD是经B95a细胞系培养纯化的 2株麻疹病毒 ,其血凝集性 (Hemadsorption ,HAD)呈阴性 .将其在Vero细胞系中培养数代后其血凝集性转变为阳性 .对在 2种细胞中培养获得的病毒进行序列分析发现 :以上 2株病毒H蛋白的第 5 4 6位均由Ser(HAD阴性 )突变为Gly(HAD阳性 ) .利用位点专一性诱变并在COS细胞中对 2种H蛋白进行表达证实 :该突变导致血凝集性的改变 ;进一步利用抗CD46的单克隆抗体证实 :该突变同时导致H蛋白与CD46受体结合功能的改变 .从而确定了第 5 4 6位氨基酸是一个新的决定血凝集性及H蛋白与CD46受体结合的重要位点 .     

微生物氧化十八烯-(9)-一酸生成1,18-十八烯-(9)-二酸研究

七十年代中期发展起来的用杂交瘤制备单克隆抗体(McAb)的技术已广泛应用于医学、生物学和农业各个领域。我国在农业研究领域内尚无建成杂交瘤细胞株的报道。农牧渔业部植物检疫实验所与中国预防医学中心病毒研究所、中国医学科学院基础所、中国科学院微生物研究所和新疆兽医研究所协作,用烟草花叶病毒(TMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与Sp 2/0鼠骨髓瘤细胞融合,获得10株能稳定传代并分泌     

牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性

通过同源重组将pHA2质粒插入到牛Ⅰ型疱疹病毒ZJ分离株基因组的UL15和UL18基因之间, 构建了重组病毒rBHV1-HA; 提取重组病毒的环状基因组DNA, 转化大肠杆菌DH10B, 获得了含有BHV1全基因组的感染性细菌人工染色体克隆pBHV1. pBHV1转染MDBK细胞可以拯救出病毒, 该病毒与野生毒株在细胞上的繁殖特性未见差异. 通过两步Red E/T重组, 构建了gN基因跨膜区缺失的pBHV1突变体, 并转染获得了重组病毒rBHV1-?gN. 病毒繁殖动态曲线显示, rBHV1-?gN的滴度比野生毒株低9%~20%. BHV1感染性克隆的成功构建, 将为研究新型BHV-1基因缺失疫苗和牛的病毒载体疫苗提供技术平台.     

烟草花叶病毒单克隆抗体的研究和应用——(Ⅲ)抗原性与基因型相关性的研究

1984年建立了烟草花叶病毒(TMV)杂交瘤细胞株,获得10个单克隆抗体(McA),并用这些McA对9省、市、自治区的14个TMV分离物进行ELISA测定,识别出8个抗原决定簇,将14个分离物分成6个抗原型。现将这些分离物分别接种具有抗TMV基因的GCR系番茄品种,观察其反应,按Pelham划分株系的方法进行归类,比较分析其结果,探索根据抗原抗体反应确定的抗原型与使寄主致病的侵染性之间的关系。