玉米候选抗病相关基因片段的克隆

根据已经克隆的植物抗病基因和候选抗病基因的保守序列P-loop、Kinase-2及GLPLAL设计一系列简并引物，利用同源序列扩增法，对玉米的基因组DNA进行PCR扩增，并对5个扩增产物的克隆进行测序，测序结果在GenBank内进行BLAST检索，发现A9克隆序列与玉米BAC库中的206C17克隆的部分序列有很高的相似性，并且距离GenBank内注册的玉米抗锈病基因rpl位点中的rpl-3基因、rpl-4基因分别约有66Kb、20Kb，且A9克隆序列在玉米基因组中是单拷贝的，这为玉米抗锈病性状的分子标记辅助选择和抗锈病基因的克隆奠定了良好的基础．     

杨树锈病抗性遗传特性及基因克隆策略研究进展

杨树全基因组测序工作显示,抗病基因往往呈簇状分布,采用合理的策略克隆出物理上独立的抗病基因,可为抗病育种工作提供捷径。笔者从杨树锈病病原菌生物学特性、寄主对锈菌的抗性、抗锈病基因克隆等几个方面分析了近年来关于杨树抗性遗传位点的确定,抗性基因克隆策略的发展及可能的应用,并对杨树抗病育种工作进行了展望。     

甘蓝抗病基因同源序列分离的初步研究

根据已分离植物抗病基因N(烟草)、RPS2(拟南芥)和L6(亚麻)的保守区域设计简并引物,从抗TuMV甘蓝材料84075第1链cDNA中扩增出1个与植物抗病基因同源的序列,经克隆测序结果表明,该基因片段与许多NBS类抗病基因同源,Southem杂交分析表明甘蓝抗病基因同源序列在基因组中以多基因家族的形式存在.     

桃抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已克隆的STK类抗病基因的保守区设计简并引物对4个不同桃的基因组DNA进行PCR扩增,将获得的扩增片段的回收产物,应用pGEM-T easy裁体试剂盒进行了目的基因片段的克隆.随机挑取若干单克隆经PCR鉴定确认后,进行测序,共获得11个各不相同的片段序列.氨基酸序列分析中,有6个片段能推导出完整的氨基酸序列.除了两侧都基本具有STK类抗病基因产物的保守结构域.     

荔枝R基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因（R基因）编码的蛋白质NBS保守区设计特异简并引物，对荔枝的基因组DNA进行体外扩增，获得了一条大小约500bp的扩增谱带；回收该特异扩增带并进行克隆，筛选若干阳性克隆进行测序，共获得5个片段的序列。同源性比较发现，该5个片段均属于NBS－LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为13.5%-45.9%。这些RGA既可进一步用于筛选荔枝的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于荔枝遗传图谱的构建。该研究表明R基因同源克隆技术可望成为荔枝抗病基因克隆和基因组研究的重要手段。     

4种鱼中DFF基因的检测

根据人类DFF基因的DNA序列，设计了一对引物，通过PCR扩增得到了该基因的一个片断，经地高辛标记作为探针对4种鱼基因组DNA（经过限制酶消化）进行了Southern杂交检测，结果表明：在鲤鱼和鲫鱼中存在一个大小为3.7Kb杂交带，在泥鳅和大鳞副泥鳅中存在的杂交带为4.5Kb，明DFF基因在进化过程中具有保守性，本研究为鱼类DFF基因的克隆奠定了基础。     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5'端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1042bp的特异性片段,连接到pMD19T载体中获得该片段克隆．经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段．DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5＇端调控区序列相比具有很高的一致性．研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础．     

高粱抗丝黑穗病SCAR标记的建立

选用高粱丝黑穗病感病恢复系矮四、抗病恢复系2381R以及二者F2代抗感个体为试验试材,采用CTAB法提取高粱基因组DNA,并应用RAPD筛选技术对高粱基因进行分子标记,选取了100对RAPD随机引物对其进行扩增,有88对引物扩增出条带。分析结果表明:88对引物中S_(405)在抗感品种间扩增出差异谱带。进一步对抗感群体进行分离分析,得出抗丝黑穗病基因重组率为11.7%。将S_(405)扩增出的差异片段进行克隆测序,差异谱带的片段长度为320bp。根据差异谱带的碱基排列顺序,设计特异性引物,然后进行序列扩增,将RAPD分子标记转化为SCAR分子标记,并将该标记命名为S_(405-320),为高粱优良品种的筛选和培育奠定一定的基础。     

广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列克隆及序列分析

目的克隆广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列,并与已发表的其它品种猪的生长激素(pGH)基因全序列进行比较,探讨该基因在广西巴马小型猪中可能存在的变异。方法以广西大学巴马小型猪基因组DNA为模板,扩增巴马小型猪生长激素基因的全序列,将该扩增片段亚克隆到pMD18-T载体后测序。再将测序结果在NCBI进行BLAST。结果测序结果证明克隆得到了巴马小型猪GH基因,全长为2 007 bp。同源性比较发现,巴马小型猪GH基因全序列与GenBank中发表的五指山猪、太湖猪及普通猪的GH基因全序列的同源性分别为99.4%、98.3%、93.9%。     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

Molecular mapping of a novel yellow rust resistance gene of wheat using microsatellite markers

Identification and genetic analysis of yellow rust resistance have suggested that wheat line R55 carries single dominant gene conferring yellow rust resistance. The bulked segregant analysis (BSA) for an F₂ population using microsatellite marker technique has indicated that the yellow rust resistance gene is located on the short arm of chromosome 1B, tightly linked to the microsatellite markers WMS11-193 bp and WMS18-184 bp, the linkage distance between the markers and the gene is 1.9 cM. This gene has been formally namedYr26. It is inferred from the pedigree, resistance and gene locus analysis that theYr26 has been transferred fromTriticum turgidum L. and is different from the other known yellow rust resistance genes.     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA（49～1 587 bp）、pMET A/NA（121～1 200 bp）,电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了依据。     

Characterization of a PDR type ABC transporter gene from wheat （Triticum aestivum L.）

DON, as a virulence factor, plays an important role in the infection of Fusarium graminearum in wheat. The infection ability of F. graminearum depends on its capacity of producing DON. The production of DON by F. graminearum is significantly decreased in the wheat varieties with scab resistance. In this study, GeneChip analysis indicated that an EST encoding an ATP-binding cassette （ABC） transporter was up-regulated by 45 times in a wheat landrace Wangshuibai, which is resistant to DON accumulation. A pair of EST-derived primers were designed based on the EST sequence, and a clone was then isolated from a wheat genomic DNA TAC library. The TAC clone was sequenced using chromosome walking and gene prediction was conducted using Softberry. A cDNA clone of this gene was subsequently isolated from Wangshuibai induced by DON using gene-specific primers designed according to the untranslated sequence of the gene. The genome size of the gene is 7377 bp, consisting of 19 exons with coding sequences of 4308 bp. It encodes a protein with 1435 amino acid residues and the calculated molecular weight is about 161 kD. BLAST analysis indicated that the gene may belong to pleiotropic drug resistance （PDR） sub-family, and hence designated as TaPDR1 （Triticum aestivum pleiotropic drug resistance）. TaPDR1 was located on chromosome 5A of wheat using nullisomic-tetrasomic lines of Chinese Spring. TaPDR1 was up-regulated by induction of both DON and F. graminearum. Expression patterns of TaPDR1 were different in wild-type Wangshuibai and the fast-neutron induced Wangshuibai mutant lacking FHB1, a major QTL of FHB resistance and DON resistance in chromosome arm 3BS. These results suggested that TaPDR1 might be a candidate gene responsible for DON accumulation resistance. The expression profile showed that TaPDR1 expression was neither induced by hormones typically involved in biotic stress, such as JA and SA, nor by abiotic stresses, such as heat, cold, wounding and NaCI. However, TaPDR1 expression was regulated by Al^3＋ and [Ca^2＋], indicating that [Ca^2＋]1 might mediate the signal of TaPDR1 expression.     

两种抗α毒素单链抗体基因的序列分析

应用RT－PCR技术,从两株分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜酸菌α毒素单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞株2E3和1A8中,分别扩增出抗体VH和VL基因,用Linker(Gly4Ser）3基因,将VH和VL基因连接成ScFv基因2E3－ScFv和1A8－ScFv,并将其克隆至pGEM-T载体中,经核苷酸序列分析证实,VH和VL基因以及Linker基因拼接正确,2E3－ScFv基因全长为729bp,经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可燮区基因特征,2E3－ScFv的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（B）和轻链kⅢ家簇;而1A8－ScFv的VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链кⅥ家簇。     

假单胞菌ND6菌株水杨酸羟化酶基因(nahG)的核苷酸序列分析和酶鉴定

水杨酸羟化酶是细菌萘降解途径中的关键酶，它能催化水杨酸脱羟和羟化，生成儿茶酚．假单胞菌(Pseudomonas)DN6菌株的萘降解基因位于102kb的质粒pND6-1上，以pUC18质粒为载体，制备了含有1～3kb pND6-1 DNA随机片段的基因库，通过DNA测序和DNA序列同源性分析，从基因库中筛选出含有水杨酸羟化酶基因nahG的克隆．nahG基因的大小为1305bp，编码的水杨酸羟化酶(NahG)由434个氨基酸组成，与Pseudomonas putida NCIB 9816-4菌株的水杨酸羟化酶基因相比，核苷酸序列的同源性为100％，与其它10种细菌的水杨酸羟化酶基因相比，核苷酸序列的同源性为32％～99％．酶学实验表明，ND6菌株的水杨酸羟化酶具有广泛的底物特异性，它不仅能代谢水杨酸，还能代谢多种水杨酸的衍生物，如乙酰水杨酸、黄基水杨酸、3-甲基水杨酸、5-甲基水杨酸和5-氯水杨酸等．     

高效热不对称交互式PCR技术克隆地黄基因

利用高效热不对称交互式PCR(hiTAIL-PCR)技术从地黄基因组中扩增出3个DNA片段,经过电泳检测、回收、纯化和测序获得2个片段的碱基序列.其中一个由578个bp组成,包含一个453bp的开放阅读框(ORF),编码151个氨基酸,与一些已知纤维素合酶基因在DNA水平和氨基酸水平的同源性分别高达81%~91%和83%~99%,而且推测蛋白质具有纤维素合酶的结构域;另一个由385个bp组成,没有ORF,不编码蛋白质,但是,预测其包含启动子元件.这些结果表明使用hiTAIL-PCR技术可以克隆地黄基因,克隆的基因将为地黄基因分子作用机制和分子育种研究奠定基础.     

Kas基因启动子区的克隆及功能初步分析

利用TAIL-PCR技术,克隆到了与辣椒素合成有关的胎座特异表达基因——3-酮酯酰．ACP合成酶基因（Kas）上游400bp的调控区域．将其全长片段与GUS基因连接构建植物表达载体并转化烟草．GUS组织化学染色表明,克隆到的440bp片段具有启动子活性．对该片段进行序列分析发现,在起始密码子ATG上游存在2个TATA-box,分别为-316～-311位的TATAAA和-224～-219位的TATAAA;在TATA-box上游还存在1个位于-378～-374处的CAAT-box,序列为CCAAT．该研究旨在为利用基因调控辣椒素的生物合成,提高辣椒果实中的辣椒素含量奠定基础．     

流感病毒H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的克隆、表达和鉴定流感病毒H3N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆流感病毒H3N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMET A上,构建了重组表达质粒pMET A/HA(52 bp～1 549 bp)、pMET A/NA(121 bp～1 260 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论本研究成功克隆和表达了流感病毒H3N2 HA、NA基因序列,为流感病毒H3N2诊断试剂和疫苗开发等进一步研究奠定了基础。