重组人甲状旁腺激素(1-34)在大肠杆菌中的表达与纯化

将化学合成的rhPTH(1-34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET-35b( ),使rhPTH(1—34)融合于纤维素结合结构域(CBDdos)的羧基端,并得到高效表达．融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经Factor Xa裂解释放出rhPTH(1-34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1-34)纯品．每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1-34)．经质谱测定,所得样品的分子量为4117．0Da,与rhPTH(1—34)理论分子量一致．     

重组人甲状旁腺素1-34在毕赤酵母克隆及表达的研究

人甲状旁腺素(Parathyroid hormone,PTH)是由人甲状旁腺主细胞分泌的直链肽,含84个氨基酸,是维持体内钙磷平衡的主要激素。PTH通过识别骨骼、小肠和肾脏等细胞表面特异性受体,与降钙素和维生素D共同调节Ca2+,PO43-的代谢,具有明显的成骨作用。研究发现,PTH的N-端34肽(PTH 1-34)具有完全的PTH受体结合能力与生物活性。目前PTH 1-34作为临床治疗骨质疏松症的注射剂已在美国上市,但价格昂贵且需要每天注射给药。而国内关于PTH1-34的临床研究很少,所以有必要通过基因工程手段获取PTH 1-34,降低成本并可大规模制备目的蛋白。本文概述了PTH近年来在国内外的研究情况,利用目前发展较快的毕赤酵母真核表达系统,构建了高效表达PTH 1-34毕赤酵母工程菌。为今后上发酵罐摸清条件。     

人甲状旁腺素的基因表达及活性的初步研究

从人甲状旁腺瘤组织中分离到ｍＲＮＡ,逆转成ｃＤＮＡ后,设计带有突变碱基的引物,通过聚合酶链式反应,扩增ｈＰＴＨ基因,使Ｎ端前５氨基酸的碱基富含腺嘌呤核苷（Ａ）．将该基因克隆到表达载体ＰＥＴＩＣ上,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）表达,实验证实ｈＰＴＨ的表达量占菌体蛋白总量的１１％;细胞粗步处理产物经腺苷环化酶的生物鉴定实验证实,重组ｈＰＴＨ具有生物活性,粗产物５００倍稀释后,ｈＰＴＨ的放免活性为２０６．５ｎｇ／Ｌ,为对照的４１５倍     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

人RANKL胞外结构域原核表达载体的构建及表达条件优化

细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of the NF-κB ligand,RANKL)是TNF超家族的重要成员之一,属于Ⅱ型跨膜蛋白,通过与其受体核因子κB受体活化因子(RANK)构建的信号通路参与乳腺癌的发生、肿瘤骨转移、骨质疏松、关节炎等病理过程。人RANKL胞外结构域基因片段与原核表达载体pET-21b融合并转化至表达菌Rosetta,并对其表达条件进行了优化。通过对诱导时机,诱导温度,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,诱导时间及甘油浓度的条件优化表明,当IPTG的浓度为0.2 mmol/mL,20℃振荡诱导培养6 h时,甘油浓度为4%时,可在上清中获得高效表达的pET-21bRANKL融合蛋白,为该蛋白的进一步纯化及结构与功能研究打下了良好的基础。     

重组人B淋巴细胞刺激因子原核表达条件的优化

以重组人B淋巴细胞刺激因子(rhBLyS)蛋白表达宿主菌株M15(pQE30a／rhBLyS)作为研究对象，借助SDS-PAGE分析方法，对于用IPTG诱导的重组目的产物的表达进行了优化研究。分析比较了pH值、裂解液种类、诱导时问、IPTG浓度、温度等参数对重组产物表达的影响．实验结果表明，降低温度和IPTG浓度有利于增加靶蛋白的可溶性，27℃和0．075mol／L IPTG为比较适合的表达条件．     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

重组胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达及培养条件的优化

采用三角摇瓶来摸索BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种表达目的蛋白的最优发酵条件,并在此基础上在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中,利用补料分批培养技术,流加甘油,进行发酵培养;利用Western blotting进行发酵产物鉴定. 摇瓶培养最优条件:10%接种量、25 mL LB培养基、37 ℃培养, 0.02 g/mL的甘油做碳源,接种后4 h加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3h后目的蛋白表达量最高. BL21(DE3)/pET28A-Tα1菌种在Biotop CF-5L自动控制发酵罐中的条件为:以10%的接种量接种到3L发酵培养基中,设定溶氧40%,pH7.0,温度37 ℃,通气量3 L/min,快速流加甘油60 g ,培养4 h后,加入终浓度为0.75 mmol/L的IPTG,诱导3 h后终止发酵. 发酵罐中获得的菌体量为36 g/L,蛋白表达率为10%左右.     

L-天冬氨酸转化菌发酵条件的优化

利用较为便宜的水解棉籽蛋白代替蛋白胨作为氮源 ,用葡萄糖部分代替富马酸作为复合碳源 ,培养产天冬氨酸酶的大肠杆菌。结果表明 ,改变培养基配比后 ,对菌体的总体酶活力 (即对底物转化能力 )影响不大 ,转化率可达 99%以上 ,通过上罐发酵初步估算可以节约培养基碳氮源成本大约 6 0 %。     

重组大肠杆菌Trx-hPTH蛋白在双水相体系内的初步纯化

用双水相体系萃取技术对重组大肠杆菌表达的人甲状旁腺激素融合蛋白Trx-hPTH进行了初步纯化,考察了盐的种类、PEG的平均分子量及浓度、MgSO4浓度、pH等因素对Trx-hPTH蛋白在PEG-MgSO4体系内分配行为的影响。结果表明:当双水相体系中w(MgSO4)=0.16,w(PEG 1000)=0.20,pH为8.0时,一步萃取后目标蛋白的分配系数为3.4,回收率为88.6%。     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子，人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hFTH)基因，将其克隆于M13载体中，DNA测序验证正确。通过PCR从含有hFTH基因的M13载体获得了该基因，将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-hFTH，电击法转化甲醇毕赤酵母(Picha pastoris)GS115菌株，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9．3kDa处有明显的诱导蛋白带，与报道的hFTH的相对分子质量相近；酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hFTH免疫活性为132ng／L。     

鸭病原性大肠杆菌I型及P型菌毛表达条件的研究

为探讨鸭病原性大肠杆菌Ⅰ型及P菌毛在体外的表达条件,用三株分别带有Ⅰ型菌毛编码基因（fim＋）,Ⅰ型和P型菌毛编码基因（fim＋／papA＋）和P型菌毛编码基因（papA＋）的鸭病原性大肠杆菌SWY-098、SWY-009、SWY-027菌株,通过对鸡、鸭和豚鼠RBC的MSHA和MRHA试验,分别从培养温度、培养时间和培养基三个方面对菌毛在体外的表达进行优化．结果表明：三株鸭病原性大肠杆菌在37℃表达菌毛,在18℃不表达菌毛;用BBL培养基37℃静止培养48h是Ⅰ型和P型菌毛在体外表达最适宜条件．     

人脂联素在大肠杆菌中的可溶性表达

为了提高重组人脂联素在大肠杆菌中的可溶性,构建和表达了增溶标签与人脂联素的融合表达栽体.这些标签包括大肠杆茵硫氧还蛋白和NusA蛋白、酿酒酵母SUMO蛋白和噬热海洋茵Thermotoga maritime 的红素氧还蛋白.结果显示,所有的人脂联素融合蛋白在大肠杆茵中都获得了高水平的表达,但可溶性存在很大差异,说明不同融合标签对人脂联素可溶性表达的促进作用不同.其中,红素氧还蛋白与SUMO蛋白组合一起对人脂联素可溶性的增强作用最为显著,其相应的融合蛋白几乎全部可溶.另外,通过酵母SUMO/Ulp1反应,经His标签亲和层析纯化得到的人脂联素融合蛋白能被有效酶切,加工为人脂联素成熟肽产物.     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

牛蛙生长激素基因cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

以成体牛蛙脑垂体总RNA为模板进行RT-PCR,克隆到牛蛙生长激素基因(bullfrog growth hormone, bfGH)cDNA编码序列,其长度为651 bp,编码的前体GH蛋白序列经BLAST分析,与已报道的牛蛙GH蛋白质序列AAB24792、AAB19428、CAA31038的同源性分别为98.1%、96.3%、95.3%,其在Genbank的登录号为AY251538;将bfGH亚克隆到原核表达载体pGEX1-λt构建成牛蛙GH原核表达载体VGBfGH,转化BL21（DE3）E.coli得     

利用细菌血红蛋白提高大肠杆菌基因工程菌几丁质酶基因的表达

将透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)插入几丁质酶基因表达质粒中,然后转入大肠杆菌(Escherichia coli)内,研究vgb基因的表达对几丁质酶基因表达和产物分泌的影响．结果表明,在不同的通氧条件下,vgb基因的表达产物均能不同程度地促进细胞的生长,而且发酵上清液的几丁质酶活性也有提高;若溶氧浓度越低,则效果越明显,可比对照提高达12．1％．同时,由于vgb在大肠秆菌的表达,还可进一步促进几丁质酶在大肠杆菌中的分泌。     

β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从一株短小芽孢杆菌H9克隆了编码葡聚糖内切酶的基因（该序列已经被已收录于GeneBank,登录号为EF620915）,序列分析表明该基因读码框为1980bp,编码659个氨基酸。预测的酶由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,第二个结构域为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成。将基因构建在大肠杆菌表达载体pET20b中得到重组质粒pET20b-EglA,将重组载体转化至大肠菌株BL21(DE3)菌株,基因在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达, SDS-电泳图谱表明酶的分子大小约为73KD。