人NLK上游启动子区的克隆与鉴定

初步鉴定并分析NLK上游启动子,为研究其转录调控打下基础。对NLK基因翻译起始位点上游约1 958 bp的序列分别进行生物信息学分析,以PCR技术扩增以上序列并测序。将PCR所得到的NLK上游片段进一步克隆到PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒PGL-3basic-luc。通过荧光素酶报告基因实验检测上述启动子的活性。成功构建了包含NLK基因上游启动子序列的荧光报告系统,经荧光素酶报告基因实验证明该重组质粒体具有转录活性。构建的NLK基因上游启动子报告基因载体为进一步研究NLK基因的转录调控机制奠定了基础。     

人MTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

人MTERF3基因编码线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。采用PCR技术对人MTERF3基因5'侧翼上游1251 bp启动子序列进行扩增,并将其克隆至荧光素酶表达载体p GL6-TA,构建人MTERF3基因启动子荧光素酶报告基因质粒。经酶切、测序鉴定后,将其用脂质体转染体外培养的HEK293细胞株,利用双荧光素酶测定系统检测其表达活性。研究结果表明,克隆获得的1251 bp DNA序列与Gen Bank报道的一致,且插入方向正确。含人MTERF3基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高(P0.05),约为对照组(空载体p GL6-TA)的9.8倍。本研究通过对人MTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶表达载体构建与表达活性的测定,为进一步阐明人MTERF3基因表达的调控机制奠定实验基础。     

赤狐ESR1基因启动子的克隆及生物信息学分析

对赤狐ESR1基因启动子区转录因子结合位点进行了预测,为今后研究其转录调控机制提供参考依据.以赤狐基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增克隆ESR1基因启动子序列,并构建至双荧光素酶报告基因载体;利用生物信息学方法对ESR1基因核心启动子区的关键转录因子结合位点进行预测.成功克隆出赤狐ESR1基因5'上游1880 bp...     

人MiTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

人MiTERF3基因编码线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。采用PCR技术对人MiTERF3基因5''侧翼上游1251 bp启动子序列进行扩增,并将其克隆至荧光素酶表达载体pGL6-TA,构建人MiTERF3基因启动子荧光素酶报告基因质粒。经酶切、测序鉴定后,将其用脂质体转染体外培养的HEK293细胞株,利用双荧光素酶测定系统检测其表达活性。研究结果表明,克隆获得的1251 bp DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人MiTERF3基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高（P<0.05）,约为对照组（空载体pGL6-TA）的9.8倍。本研究通过对人MiTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶表达载体构建与表达活性的测定,为进一步阐明人MiTERF3基因表达的调控机制奠定实验基础。     

GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

目的转录因子GATA-3在人乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色,研究其转录调控有重要意义.方法从人乳腺癌细胞系MCF-7提取基因组DNA为模板,以PCR方法扩增获得GATA-3启动子序列,将片段克隆到pGL3-Basic载体内,鉴定后通过报告基因检测系统检测GATA-3启动子报告基因的荧光素酶活性.结果双酶切、基因测序鉴定结果显示,成功构建了GATA-3启动子报告基因,并在MCF-7细胞内鉴定了其具有荧光素酶的表达活性.结论本实验成功构建了GATA-3启动子报告基因载体pGL3-GATA-3pro-Luc,为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.     

人NRAGE基因启动子转录活性的初步研究

利用生物信息学软件搜寻NRAGE启动子区域的转录因子结合位点,并根据这些位点利用PCR技术克隆NRAGE启动子不同区域的缺失突变体,分别插入Luciferase报告载体pG13-Basic载体中,构成8种缺失突变体的报告基因表达载体.通过双荧光素酶体系检测在HEK-293细胞中NRAGE启动子不同区域的转录活性,从而确...     

不同亚型人SMYD3启动子转录活性比较

利用PCR方法克隆SMYD3两个亚型的启动子区域,并构建其荧光素酶报告质粒.转染COS-7细胞后,利用荧光素酶报告分析技术,对二者启动子的转录活性进行了检测和比较.结果显示:SMYD3亚型1启动子的转录活性要显著高于亚型2启动子,生物信息学分析提示其原因可能与含有转录因子E2F-1结合位点的串联重复序列有关.     

氯化钴对人的eNOS基因启动子SP1改构体转录活性的影响

目的:构建改造的人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子,利用氯化钴诱导的人脐静脉血管内皮细胞-12缺氧模型研究其基因启动子活性的变化.方法:用不同剂量的氯化钴体外处理细胞复制缺氧模型,PCR点突变技术构建突变启动子pGL2-eNOS-insSP1,分别将pGL2-eNOS-insSP1和pGL2-eNOS-p载体导入HUVEC-12细胞,双荧光素酶报告基因技术用于检测启动子转录活性的变化.结果:DNA测序显示人的eNOS基因启动子SP1改构体的序列正确;改构体eNOS启动子活性在一定范围内随氯化钴刺激剂量的增加而升高.结论:SP1插入改造的方法显著提高了eNOS基因启动子的转录活性.     

以MDR1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

通过构建以MDR1启动子为启动序列的荧光素酶报告基因载体,建立基于双荧光素酶报告基因系统的多药耐药抑制剂筛选模型。从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子的序列。将该序列重组到荧光素酶报告基因载体pGL-3-Basic的启动区域中,从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8/VCR细胞中,建立用于筛选多药耐药抑制剂的方法。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。通过MDR1基因激活剂（热诱导）和抑制剂（EGCG）来验证该方法。通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子序列且没有出现碱基突变。在n（pGL-MDR1）∶n（pRL-TK）=5∶5时,转染效率最高并具有最高的荧光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达,而MDR1基因抑制剂的作用则相反。     

人cidec基因启动子的克隆及 PPARγ 上调其活性大小比较研究

人诱导细胞死亡的 DFF45 样效应因子 C(Cell death-inducing DNAfragmentation factor 45-like c,cidec)可调节脂肪代谢,与动脉粥样硬化有密切联系,研究显示该因子表达受到过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的调节,但其中的表达机制还不清楚。从人肝癌细胞 HepG2 中扩增 cidec基因启动子不同长短片段,分别克隆到虫荧光素酶报告基因载体中;cidec 基因启动子片段重组报告基因质粒转染HepG2 细胞,经 PPARγ 激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,ROZ)处理后,检测荧光素酶活性。结果发现,cidec 基因启动子(-1 800～+150 bp)加 ROZ 前后均无明显变化,而 cidec 基因启动子(-2 289～+150 bp)质粒荧光素酶活性明显增加,且加 ROZ 后活性显著升高(p<0.05)。这表明激活 PPARγ 可能通过 cidec 基因启动子的-2 289～-1 800 bp 区域 PPARγ结合元件而上调该基因转录活性。
     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

MEK5α和MEK5β调控Beclin 1启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因,调控自噬起始和自噬体成熟.在肌肉分化过程中,Beclin 1基因表达上调,自噬增加;此外MEK5-ERK5信号活化并调控成肌细胞分化.因此,在肌肉分化过程中,MEK5-ERK5信号通路可能调控Beclin 1基因表达.目的是阐明MEK5对成肌细胞Beclin 1基因启动子活性的调控.将不同长度Beclin 1启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12.双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,含Beclin 1基因起始密码子上游586碱基对DNA片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性.MEK5α显著增加p-354荧光素酶活性,并有剂量依赖性;而MEK5β显著降低p-354荧光素酶活性.MEK5β能够拮抗MEK5α对p-354荧光素酶活性的调控.与MEK5对Beclin 1基因启动子调控结果一致,MEK5αCA上调细胞Beclin 1 mRNA表达,MEK5βDD下调Beclin 1mRNA表达,并且MEK5βDD抑制MEK5αCA对Beclin 1 mRNA表达的促进作用.此外,转录因子CREB家族成员CREB3,CREBP和CREBL1能够显著上调p-354荧光素酶活性.CREB3呈剂量依赖性显著上调p-354荧光素酶活性,并与MEK5α具有协同效应.MEK5α和MEK5β对Beclin 1启动子具有不同调控作用,CREB可能是其下游效应因子.     

山羊Agouti基因启动子活性区域探究

对前期拼接获得的12 847 bp山羊Agouti基因序列(EF587236和JN651404)进行启动子活性区域预测,确定候选启动子区为6 450~7 100 bp,得到一个长度为2 537 bp的DNA片段,在该区域发现一个典型转录因子结合位点TATA框,并预测到HSF,SYR,GATA-1,Nkx-2,ADR1等多个转录因子结合位点;山羊基因组序列(登录号:AJPT01136617.1)中有两段序列与牛的预测启动子promoter A和promoter B同源性较高,据此设计引物扩增目的片段,同时构建12个荧光素酶报告基因质粒,瞬时转染人皮肤黑素瘤细胞A375和293T细胞检测目的片段是否具有Agouti基因启动子活性。结果表明,所构建的目的片段质粒与阴性对照相比无显著差异,说明所获得的目的片段不具有启动子活性。     

MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 调控 ${\bf Beclin}$ 1 启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因, 调控自噬起始和自噬体成熟. 在肌肉分化过程中, Beclin 1 基因表达上调, 自噬增加; 此外 MEK5-ERK5 信号活化并调控成肌细胞分化. 因此, 在肌肉分化过程中, MEK5-ERK5 信号通路可能调控 Beclin 1 基因表达. 目的是阐明 MEK5 对成肌细胞 Beclin 1 基因启动子活性的调控. 将不同长度 Beclin 1 启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12. 双荧光素酶报告基因检测实验结果显示, 含 Beclin 1 基因起始密码子上游 586 碱基对 DNA 片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性. MEK5$\alpha $显著增加 p-354 荧光素酶活性, 并有剂量依赖性; 而 MEK5$\beta $ 显著降低 p-354 荧光素酶活性. MEK5$\beta $能够拮抗 MEK5$\alpha $对 p-354 荧光素酶活性的调控. 与 MEK5 对 Beclin 1 基因启动子调控结果一致, MEK5$\alpha $CA 上调细胞Beclin 1 mRNA 表达, MEK5$\beta $DD 下调 Beclin 1 mRNA 表达, 并且 MEK5$\beta $DD 抑制 MEK5$\alpha $CA 对 Beclin 1 mRNA 表达的促进作用. 此外, 转录因子 CREB 家族成员 CREB3, CREBP 和 CREBL1 能够显著上调 p-354 荧光素酶活性. CREB3 呈剂量依赖性显著上调 p-354 荧光素酶活性, 并与 MEK5$\alpha $ 具有协同效应. MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 对 Beclin 1 启动子具有不同调控作用, CREB 可能是其下游效应因子.     

猪生长激素受体(GHR)基因启动子的 克隆及功能分析

本研究以猪作为研究模型, 对GHR基因启动子区开展了克隆 、转录因子结合位点分析和启动子活性鉴定.结果表明: 家猪GHR基因或由两个启动子(GHR P1和GHR P2)控制.GHR P1的部分核苷酸序列与牛、羊对应核苷酸序列具有较高的同源性, 但功能分析显示其启动子活性较低.针对GHR P2的实验结果表明其具有典型的GHR组成型启动子特征, 荧光素酶报告实验表明其具有启动子活性, 因此我们推测本次克隆获得的GHR P2是猪GHR的组成型启动子.     

OSP-1启动子在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性研究

为获得能在猪卵巢颗粒细胞中高效表达的启动子,本文检测了大鼠卵巢特异性启动子OSP-1(Ovarian specific promoter)在猪卵巢颗粒细胞中的转录活性。参考大鼠OSP-1启动子序列扩增大鼠OSP-1片段,将其定向克隆到pc DNA3.1(+)中替代CMV启动子,并在其下游插入Zs GREEN基因片段,构建真核表达载体p OSP-1-Zs GREEN;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000的介导下转染不同细胞,在荧光显微镜下观察Zs GREEN表达情况,Realtime-RT-PCR方法检测该启动子在不同细胞中启动Zs GREEN基因表达的活性。结果表明:经克隆测序,得到了465bp OSP-1启动子序列,重组质粒转染卵巢颗粒细胞、Hela细胞可以观察到绿色荧光。Realtime-RT-PCR结果显示:Zs GREEN基因在卵巢颗粒细胞、Hela细胞中高表达,在肌细胞中表达量极低;说明OSP-1启动子可驱动外源基因在猪卵巢颗粒细胞中高效表达,可为构建可用于猪卵巢颗粒细胞的表达载体提供了启动子。     

sⅡ系列缺失启动子载体的构建

为检测新型sII根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sII基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段.在启动子片段的5'和3'端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载体pBI121和pBITM2MARⅡ中,取代原有的组成型启动子CaMV35S,获得了四个含有胡萝卜根部特异启动子sII基因不同缺失片段区域与GUS报告基因的融合检测载体.该系列载体通过农杆菌介导转入胡萝卜,检测sII不同长度片段启动子在胡萝卜根部驱动报告基因的表达情况,分析该启动子的功能.     

Nodal基因5′末端侧翼序列启动子的分析

为了鉴定Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件,将Ｎｏｄａｌ基因５′侧翼序列的各缺失片段构建以荧光素酶为报告基因的重组质粒。用这些拾报告基因的质粒转化Ｆ９细胞并测定了它们的瞬时表达荧光素酶海性。Ｎｏｄａｌ基因的基本启动子元件位于转录起始位点上游约６０ｂｐ,其中含有一个位于－３３ｂｐ处的ＴＡＴＡｂｏｘ,它对于转录起始起着重要作用。这个基本启动子在多种细胞类型中都有活性,但其活性不强。     

原核生物pPLacZ报道分子系统的构建及鉴定

构建可以鉴定原核基因启动子和检测基因转录活性的报道分子系统pPLacZ。用PCR方法从野生型大肠杆菌基因组DNA中扩增lacZ基因的全基因序列（3258bp）和结构基因序列（3089bp）克隆人经改建的含有pUCl9的多克隆位点的pBR322载体中．经酶切和测序鉴定正确的两个质粒分别命名为pPLacZ—Control和pPLacZ—Basic。用PCR从野生型大肠杆菌基因组DNA中扩增热休克基因htpX的启动子序列并克隆JkpPLacZ—Basicq中。经酶切测序鉴定正确的报道载体pPLacZ—htpX转入细菌中,检测高温应激时β-半乳糖苷酶活性水平。成功构建了原核生物报道分子系统pPLacZ以及检测基NhtpX的报道质粒pPLacZ—htpX。应用此系统通过检测IJacZ的比活性成功测定了大肠杆菌htpX基因高温应激时其转录活性的动态变化。原核生物质粒报道分子系统pPLacZ操作简便,可替代国际通用的原核噬菌体报道分子系统对原核基因的启动子进行鉴定和转录活性检测。     

棉花曲叶病毒反式作用因子AC2对病毒链基因启动子的调控作用

以棉花曲叶病毒(CLCuV)侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增CLCuV反式作用因子AC2并插入克隆载体.将AC2置于CaMV35S启动子下构建了瞬时的表达载体.通过基因枪法将质粒载体导入烟草和棉花叶片细胞中进行瞬时表达.结果表明,在反式作用因子AC2的激活下,病毒链基因启动子的活性明显增强,然而激活后的病毒链基因启动子的活性仍低于互补链基因方向启动子;其表达方式与互补链基因启动子相似,即在叶肉及维管组织均有较高的活性.此外还探讨了AC2应用于植物遗传操作的可能性.