重组DNA的研究新进展

本世纪70年代初,美国科学家S. Cohen和H. Boyer等首次在体外成功地组建了具有生物功能的重组质粒,1974年,Morrow等将第一个真核基因即瓜蟾rRNA基因导入大肠杆菌,获得克隆,标志着重组DNA(rDNA)研究的开始。rDNA技术,是在试管内用酶及其他物质使不同物种间的DNA分子彼此结合,然后导入细胞内令其行使功能的技术。它涉及五个方面:1)DNA特异的剪切技术——获取目的基因;2)核酸分子杂交技术——鉴定未知核酸分子;3)DNA的分子克隆——目的基因的扩增;4)DNA顺序测定——确立基因的精细结构和功能的关系;5)目的基因的表达——产     

水稻质体发育过程中DNA分子动态变化的初步研究

有关高等植物质体发育过程中DNA分子的动态变化,迄今仅在小麦中有报道。本文报道我们应用DNA专一荧光染料DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)同质体DNA的结合,对水稻质体发育过程中质体DNA的动     

云南4个少数民族的随机扩增多态DNA分析

1990年,Williams和Welsh领导的2个小组几乎同时独立地发展起来一项新技术,即随机扩增多态DNA(Random amplified polymorphic DNA,RAPD).该技术通过PCR进行DNA扩增,所用引物是G C含量为50%—70%的单个随机短引物,这些引物在一定的退火条件下能与基因组DNA中的互补顺序配对,启动DNA的合成.RAPD具有以下特点:(1)无需预先知道受试有机体基因组DNA的序列,因而能应用于所用的生物体;(2)绝大多数     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒全长可读框的表达及其产物免疫原性分析

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)全长约为6.9 kb的可读框(ORF)克隆到家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中, 构建重组家蚕杆状病毒转移质粒pVL-ORF. pVL-ORF与线性化的亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 经空斑筛选后成功获得携带有FMDV全长ORF的重组病毒Bm-ORF. 免疫荧光技术证明, 重组病毒能够正确表达插入的外源基因. 将获得的重组病毒Bm-ORF感染家蚕5龄起幼虫, 双抗体夹心ELISA法和电子显微镜观察证明, 目的基因在蚕体中获得较高水平表达并组装成空衣壳. 用蚕表达产物作抗原制备疫苗免疫牛, 免疫动物均产生了特异性抗体. 免疫后21 d进行病毒攻击保护实验, 获得了2/4的完全保护.     

质粒pBN119在大肠杆菌HB101中的分子间重组

高等植物叶绿体DNA中除蚕豆等六种豆类外,都有两个20—28kb的反向重复顺序,rDNA位于反向重复顺序内。已有实验证明,反向重复顺序之间能不断地发生分子内及分子间的重组。有人认为反向重复顺序能促进两个拷贝的重组并能进行异源修复,才使经长期进化后这两个反向重复顺序仍保     

又一个例证——SV40 DNA的全核苷酸顺序

病毒SV40以及多瘤病毒作为直核细胞基因结构和表达的模型已被深入研究。 SV40 DNA是一个超螺旋的、环状的双链DNA,它的全核苷酸顺序(5224个碱基对)已发表。全顺序的测出,能够在基因组上确定已知基因的位置。基因组中至少有15.2％是不翻译成多肽的。全顺序可分为早转录区和晚转录区两大区段。早转录区编码两个蛋白质——t抗原和T抗原,二者的基因起始于同一位置,并共用一段约300个碱基对长的片     

CpG DNA增强口蹄疫病毒DNA疫苗诱发豚鼠产生的免疫应答

CpG DNA是一些具有免疫刺激作用的核苷酸序列,这些序列在DNA疫苗诱发机体产生的免疫应答中起着重要作用。设计并化学合成了一段含CpG DNA的寡核苷酸,将其插入编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶及O型口蹄疫病毒抗原表位融合蛋白的表达质粒中,并观察了其对重组质粒介导的免疫应答的影响。结果显示,插入的寡核苷酸能增强重组质粒诱发豚鼠产生的病毒中和抗体及T细胞增殖反应,并能提高豚鼠的抗病毒感染能力,证明将CpG DNA克隆进DNA疫苗中提高DNA疫苗免疫活性的一条有效途径。同时,构建的DNA疫苗为抗口蹄疫DNA疫羁的应用奠定了一定的基础。     

莲子叶细胞中淀粉质体核糖体的观察和分离

莲胚子叶细胞的淀粉质体在原质体时期就能观察到似细胞质中的核糖体颗粒 ,随着发育时期的递增 ,质体中产生一些管状复合体膜和片层结构 ,在这些膜结构的疏松区和基质中存在着一些似细胞质中的核糖体颗粒 .在物质积累盛期 (受精后的15～20d) ,随着淀粉质体的进一步发育 ,大量的淀粉和DNA在这些质体中合成 .同时在这些质体中出现丰富的形态学上结构清晰的核糖体颗粒 ,其中有些形成螺旋状结构 .从受精后生长到16～18d的莲子叶中分离纯化淀粉质体 ,在蔗糖密度梯度离心中获得淀粉质体核糖体区带 ,并对其RNA和蛋白质含量进行了测定.     

乙型肝炎病毒DNA的克隆及其在猴肾细胞中的初步表达

自从乙型肝炎病毒(HBV)基因克隆成功以后,人们开始用重组DNA技术来解决HBV或其表面抗原(HBsAg)在培养细胞中的表达问题,并已相继取得进展。我们克隆了     

ftsZ基因与质体的分裂

质体是植物细胞中一类重要的细胞器, 其正常分裂过程与植物细胞的分化和发育密切相关. 人们对于质体分裂的早期研究主要集中于质体分裂过程的形态学观察和对某些突变体材料的遗传学分析, 而对于控制质体分裂的分子基础尚无明晰的认识. 近年来, 随着原核细胞分裂基因类似物在植物中的发现以及对质体进化祖先原核生物细胞分裂机制的解析, 极大地促进了人们对质体分裂机制的认识. 通过对分裂相关基因的功能研究, 人们认为作为内共生产物的质体可能与其原核祖先具有相似的分裂机制, 特别是对在分裂过程中发挥关键作用的ftsZ基因功能的深入研究为人们从分子水平上认识质体分裂的机制奠定了坚实的基础. 本文对质体分裂的研究历史进行了简单的回顾, 并对近来质体分裂分子机制的研究进展做一简要评述.     

ftsZ基因与质体的分裂

质体是植物细胞中一类重要的细胞器, 其正常分裂过程与植物细胞的分化和发育密切相关. 人们对于质体分裂的早期研究主要集中于质体分裂过程的形态学观察和对某些突变体材料的遗传学分析, 而对于控制质体分裂的分子基础尚无明晰的认识. 近年来, 随着原核细胞分裂基因类似物在植物中的发现以及对质体进化祖先原核生物细胞分裂机制的解析, 极大地促进了人们对质体分裂机制的认识. 通过对分裂相关基因的功能研究, 人们认为作为内共生产物的质体可能与其原核祖先具有相似的分裂机制, 特别是对在分裂过程中发挥关键作用的ftsZ基因功能的深入研究为人们从分子水平上认识质体分裂的机制奠定了坚实的基础. 本文对质体分裂的研究历史进行了简单的回顾, 并对近来质体分裂分子机制的研究进展做一简要评述.     

重组LacZ′基因的非常规表达

从DNA→mRNA→蛋白质的过程是极其复杂的,原核生物及真核生物细胞合成的某些蛋白质的氨基酸顺序并不总能按通用的三联密码框架从DNA或mRNA顺序中推导出来,推导的顺序与真正的顺序的差异可能来源于转录后加工过程,也可能来源于翻译过程,这些包括RNA剪接(RNA splicing)、RNA编辑(RNA editing)、翻译的重新起动(reinitiation)及核糖体移码(ribosomal frameshifting)等.这些基因表达方式的发现大大推动了对生命规律的认识,并已经成为生命科学的重要基石.     

以EBV复制子载体为基础的新型重组AAV载体包装系统

重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒.     

表达EIAV Gag蛋白的DNA载体与重组痘苗病毒联合免疫效果的观察

将中国马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株的gag基因通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株的TK区, 经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv-DLVgag和rvv-LNgag. Western blot检测可知重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Gag蛋白. 使用本实验室构建的表达EIAV DLV和LN Gag蛋白的DNA载体单独或与表达相应蛋白的重组痘苗病毒联合免疫小鼠, 结果表明各免疫组小鼠体内均产生了针对EIAV的特异性体液和细胞免疫应答. 统计学分析显示, 联合免疫组与单独免疫组相比, 诱导的特异性结合抗体滴度无显著性变化, 而淋巴细胞增殖应答和CTL水平则显著增强, CTL杀伤率最高可达31%, DLV Gag蛋白与LN Gag蛋白诱导的免疫应答强度无显著性差异. 研究结果有助于阐明我国按照传统路线研制成功的EIAV弱毒疫苗的免疫机制, 并为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定基础.     

耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立

PprI是近来在耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中发现的一个极其重要的DNA修复开关基 因. 以已测序的野生型菌株R1为材料, 运用PCR突变法将克隆具有自身GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段反向重组到pprI基因中去, 首次获得了卡那霉素抗性的、pprI功能完全破坏的突变株YR1. 辐射细胞生存率结果表明, YR1对辐射异常敏感. 另外, 将含有GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段重组到质粒pRADZ3中, 获得了具有卡那霉素抗性的表达质粒pRADK; 再将体外克隆的具有pprI完整基因和C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段分别重组到pRADK中. 研究结果表明, 含有pprI完整基因的表达质粒在YR1中能够正常表达, 并完全恢复到野生型的极端抗性; 而C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段虽能在YR1中正常表达, 但对辐射异常敏感, 不能恢复其极端抗性. 上述pprI基因功能缺陷性和功能补偿性突变株的建立, 为深入研究细胞体内PprI蛋白质的定位、结构域与功能的关系, 以及原位研究PprI蛋白质的理化特性提供了十分有效的方法     

莲子叶细胞中淀粉质体核糖体的观察和分离

莲胚子叶细胞的淀粉质体在原质体时期就能观察到似细胞质中的核糖体颗粒 ,随着发育时期的递增 ,质体中产生一些管状复合体膜和片层结构 ,在这些膜结构的疏松区和基质中存在着一些似细胞质中的核糖体颗粒 .在物质积累盛期 (受精后的 15～ 2 0d) ,随着淀粉质体的进一步发育 ,大量的淀粉和DNA在这些质体中合成 .同时在这些质体中出现丰富的形态学上结构清晰的核糖体颗粒 ,其中有些形成螺旋状结构 .从受精后生长到 16～ 18d的莲子叶中分离纯化淀粉质体 ,在蔗糖密度梯度离心中获得淀粉质体核糖体区带 ,并对其RNA和蛋白质含量进行了测定 .     

水稻花粉白苗质体DNA含量的荧光显微光度术测量

禾本科植物花药培养产生大量白化苗,是开展单倍体遗传研究和育种应用的重要障碍问题,使得花粉白苗及其控制途径的研究成为这一领域的研究热点。关于花粉白苗质体DNA缺失最直接的报道迄今仅有Day(1984)采取从细胞全DNA间接分析质体的方法发现小麦     

苯并[a]芘代谢物与DNA互补碱对交联产物几何构型的PM3计算

自从双区理论提出以来,多种有机致癌剂的结构和致癌活性的关系(QSCAN)得到了成功的理论解释和定量表征.据双区理论的原则设计开发的几种顺铂类似物也显示出具有高于顺铂和碳铂的抗癌活性.根据双区理论,化学致癌作用的关键步骤是具有双官能亲电活性中心的最终致癌剂与DNA互补碱基对的横向交联.这种交联产物及其结构特征对于深入探讨致癌机理具有重要意义,也是引人关注的问题.但因DNA横向交联的量很少,以致难以进行实验观察.本文采用半经验分子轨道法 PM3对强力致癌剂苯并[a]芘(BaP)经代谢活化产生的最终致癌剂与DNA互补碱基对的横向交联产物进行了全几     

人神经营养素-3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

将人NT 3基因插入 pPAK9中后与Bsu36Ⅰ酶切的Bac6昆虫杆状病毒基因组DNA共转染sf2 1细胞 ,以空斑法分离重组病毒 .狭缝杂交、细胞免疫化学染色和背根节无血清培养证明NT_3整合入Bac6DNA中 ,表达并分泌至胞外 .2 0 0mL培养上清经CMSepharoseFastFlow纯化得到 2 0 0 μgNT_3纯品 ,其最大生物效应浓度为 4ng/mL .     

基于品位耦合的光煤互补发电系统集成理论分析

光煤互补发电系统是一种将聚光太阳能与化石燃料化学能相结合的互补发电系统.已有光煤互补发电系统研究多为针对具体互补形式或具体光煤互补电站的案例研究,目前尚缺乏统一性的理论.本研究摆脱具体互补形式的限制,基于品位耦合思想,对光煤互补发电系统整体建模并进行统一性理论分析,提出了更为合理的光煤互补发电系统统一评价标准——节煤系数,并获得了适用于各类互补形式的统一理论表达式.该表达式指出了不同光煤互补发电系统间的联系与区别,揭示了节煤系数的"叠加效应".通过对表达式的详尽分析,明确了太阳能投入份额和太阳能集热品位同工质品位的匹配程度为节煤系数的主要影响因素.研究结果对于光煤互补电站设计以及各类燃煤电站的光煤互补改造均具有重要的理论指导意义.