异戊烯基转移酶基因的克隆与转化烟草的研究

从根癌农杆菌中克隆了异戊烯基转移酶基因,构建了植物表达载体p35S-ipt(pVCT2131).用此载体转化烟草,结果表明,ipt在CaMV 35S启动子的控制下,可以大大提高烟草愈伤组织诱导率.     

抗冻肽基因在植物表达载体中的构建

植物表达载体P^Bin438经HindⅡ和EcoPⅠ双酶切,回收其HindⅡ－BmaHⅠ-Sal-EcoRⅠ片段和P^UC19HⅢ-EcoRI片段连接,构建成载体记为P^UC38。将含AFP基因的克隆经BamHI,XhoⅠ双酶切,得到的BamHI-AFP-XhoⅠ片段装入P^UC38BanHI-SalⅠ位点,克隆AFP基因。然后再用HindⅢ、EoR1双酶切AFP基因,插入P^Uin438的HindⅢ-EcoRⅠ位点,进而构建成带有AFP基因的植物表达载体,为进一步研究AFP基因在植物中表达奠定了基础。     

人乳铁蛋白基因克隆及表达载体构建

通过ＰＣＲ法扩增出２３６６bp的人乳铁蛋白cDNA、８００bp的山羊β－乳球蛋白基因５′端调控序列,经ＰＣＲ反应连接后,克隆到表达载体pLNCX中,测序结果表明,与ＧeneBank中登录的序列相比,所获人乳铁蛋白cDNA序列的同源性为９９．７４％,山头β－乳球蛋白基因５′端调控序列的同源性为９９．７５％。酶切结果证明得到了正确的重组载体,可用于乳腺生物反应器的研究。利用ＰＣＲ反应直接克隆目的片段,并通过同源序列进行ＰＣＲ连接,极大提高了克隆的速度和准确性,,为基因克隆及其表达研究带来了方便。     

豌豆凝集素基因的克隆与植物表达载体的构建

为研究凝集紊基因转化非豆科植物后对根瘤菌的识别作用,设计特异引物扩增出豌豆凝集紊基因,并对基因序列进行比对分析．将豌豆凝集紊基因克隆到载体pVCT2020中,获得植物表达载体pVCT—PsL．该载体可用于转化烟草等非豆科植物．     

拟南芥HIS1-3基因克隆及表达载体构建

文章提取拟南芥植株总RNA,通过RT-PCR扩增出HIS1-3基因的cDNA片段,连接到pEASY-T1Simple载体上,转化到Trans1-T1感受态细胞内,筛选阳性单克隆并抽提质粒。利用限制性内切酶Eco91Ⅰ和NcoⅠ对质粒pEASY-T1-HIS1-3和植物表达载体pCAMBIA2301进行完全双酶切,通过电转化法,将重组表达载体pCAMBIA2301-HIS1-3导入根癌农杆菌C58中以期获得携带HIS1-3基因的根瘤农杆菌株,为研究HIS1-3基因的抗逆分子机理以及遗传改良作物抗逆性奠定了基础。     

乙肝病毒表面抗原基因植物表达载体的构建

报道了将乙型肝炎病毒（ａｄｗ亚型）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因和ＨＢＡｇ及其前导序列（ＨＢｓＡｇ＋ｐｒｅＳ２）基因分别插入植物表达载体ｐＲｏＫⅡ的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子下游,构建为重组质粒ｐＲＨＢ和ｐＲＰ,并将其分别导入农杆菌ＬＢＡ４４０４中。     

ChsA启动子驱动的IPT基因植物表达载体的构建

为研究异戊烯腺苷类细胞分裂素与花衰老进程的相关性,本研究通过PCR方法从矮牵牛中克隆到花瓣特异性表达的矮牵牛查尔酮合成酶基因A(ChsA)的启动子PchsA,并以其取代植物表达载体pBI121中的组成型启动子CaMV35S,然后将IPT基因插入到PchsA启动子下游,测序结果显示花瓣特异性启动子驱动的IPT植物表达载体构建成功.     

黑曲霉F246的phyA基因克隆及其新型表达载体构建

利用PCR法直接从自行筛选、鉴定的黑曲霉F246中扩增出phyA基因,再将PCR产物重组于乳酸菌表达载体pMG36e,构建phyA基因的新型表达载体pMG36e-phyA.以黑曲霉F246基因组为模板,对phyA基因的成熟肽(1 347 bp)进行PCR扩增.再将PCR产物克隆入pMD18T质粒,经DNA测序和氨基酸分析、鉴定正确后,亚克隆入乳酸菌表达质粒pMG36e,构建工程菌Lactobacillus MG1363-pMG36e-phyA.重组乳酸菌表达载体pMG36e-phyA的构建,可望获得大量、高活性植酸酶,为研制多功能微生态制剂奠定基础.     

人类8型疱疹病毒K1基因真核表达载体的构建

为构建人类8型疱疹病毒(Human herpesvirus 8,HHV-8)K1基因的真核表达载体,采集卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)患者血清,采用柱式病毒DNA抽提试剂盒抽提血清中的病毒DNA,采用套式PCR技术检测HHV-8的特异性片断KS330233以判断是否得到了HHV-8 DNA,采用PCR技术扩增HHV8 K1基因并纯化回收,酶切、连接入真核表达载体pcDNA3.1,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆pcDNA3.1/HHV8-K1扩增后,提取质粒,进行双酶切和DNA测序鉴定.结果显示采集了经典型KS血清3例,提取了血清HHV-8DNA,扩增了特异性片断KS330233,测序结果正确提示我们得到了HHV8 DNA,扩增了HHV8 K1基因,构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性.由此可知:成功构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定良好的实验基础.     

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

甜味蛋白thaumatin-PDI二价植物表达载体的构建

将thaumatin cDNA和PDI基因的上游分别连上启动子,下游连上终止子,通过基因重组技术,克隆到植物表达载体pCAMBIAl302中,构建成一个同时含有thaumatin基因和PD／基因的新的植物二价表达载体pCAMBIAl302-tha-PDI.经测序,该表达载体中的thaumatin基因与PDI基因的编码阅读框序列完全正确。     

甜味蛋白thaumatin表达载体的构建

将克隆在不同质粒上的thaumatin基因的两个片段连接起来，连接产物克隆到质粒pUC18上．测序结果表明，连接产物是一个完整的thaumatin cDNA基因．将此基因通过基因重组技术，克隆到植物表达载体pBI121中，构建了一个新的转化植物的表达载体-pBIl21-tha.     

法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及双元载体的构建

以留兰香(MenthaspicataL)为材料,利用RT PCR方法克隆法呢基焦磷酸合酶基因(fps)的cDNA,核酸序列分析表明,该基因的编码区长1050bp,编码349个氨基酸.进一步将fps基因插入植物表达载体BinAR,酶切鉴定及测序结果都证明fps的植物双元表达载体构建成功,为fps基因在烟草中的异源表达奠定了基础.     

Fractalkine基因真核表达质粒的构建及其在小鼠肝癌细胞中的表达

为克隆小鼠趋化因子Fractalkine(．FK)基因，构建真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞中表达，用以进行肿瘤的基因治疗，用RT-PCR法，从小鼠乳腺癌细胞D2F2扩增FK的cDNA，插入pCR2．1 TOPO载体，测序证实后，将其亚克隆至质粒pIRES中构建FK真核表达载体；用脂质体将重组质粒转染小鼠肝癌MM45 T．Li细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，用RT-PCR和免疫化学方法鉴定转染细胞中FK基因的表达．结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT-PCR和免疫化学方法证明转基因MM45T．Li细胞克隆中存在小鼠FK基因的表达。     

查尔酮合酶基因的克隆及双元载体的构建

以中国水仙为材料，利用RT-PCR方法克隆查尔酮合酶基因(CHS)的cDNA，核酸序列分析表明，该基因的编码区长1167bp，编码389个氨基酸，通过进一步的中间克隆，将CHS连上CaMV35s启动子和Tnos终止子。进一步将重组片段插入植物表达载体pCAMBIA1301,PCR及测序结果都证明植物双元表达载体p1301BΩＣ构建获得成功。为进一步在植物中表达CHS奠定了基础。     

全长人lrp基因及其截短和定点突变体真核表达载体的构建

为了对脂多糖应答基因（lrp）的功能进行深入的研究,实验用PCR及双PCR法扩增出lrp基因的截短体（lrp△C）和突变体（lrpm）序列,测序正确后将正常lrp基因及其截短体和突变体序列均连入真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-lrp、pcDNA3．1（＋）-lrp△C和pcDNA3．1（＋）-lrpm。DNA测序结果显示,PCR反应成功得到了lrp基因的截短体和突变体序列;重组质粒酶切鉴定结果显示：人lrp基因及其截短体、突变体成功连入了真核表达载体pcDNA3．1（＋）。     

副粘病毒Tianjin株F基因真核表达载体的构建及初步鉴定

为研究仙台病毒主要表面抗原f蛋白对小鼠的免疫效果,应用RT-PCR从副粘病毒Tianjin株基因组中扩增出F基因,将其插入pcDNA3的Pcmv下游,构建了F基因真核表达载体,同时使用PCR、限制性酶切和测序等方法对其进行了鉴定,鉴定结果证实构建成功.构建好的F基因真核表达载体可为下一步的体外表达和动物免疫实验奠定基础.     

含多种抗真菌病基因植物表达载体的构建

含有大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ） 编码序列的质粒ｐＲＣ２４／ＢＲＩＰ改造后, 依次与含有水稻碱性几丁质酶基因ＲＣＨ１０ 和水稻酸性几丁质酶基因ＲＡＣ２２ 编码序列的质粒ｐＡＢＣ２ 以及含有苜蓿β１ , ３葡聚糖酶编码序列的质粒ｐＡＡＧ８９ 连接, 得到了中间载体ｐＲＡＳ１０ ．ｐＲＡＳ１０再与根癌农杆菌双元载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 连接, 得到了适合水稻转化的双元载体ｐＲＡＳ１３００ ． 利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４ 中, 并准备将ｐＲＡＳ１３００ 转入水稻, 以期获得对真菌病有广泛且较强抗性的水稻品种     

bFGF真核表达载体构建及表达

旨在构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor,简称bFGF）的真核表达载体，以便用于研究bFGF基因治疗在骨组织工程中的应用，应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1上，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况，酶切，PCR和DNA测序结果均证实了插入片段的正确性，免疫组织化学检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结果表明已成功构建了bFGF真核表达载体pcDNA3.1-bFGF，并且bFGF能够在3T3细胞表达。     

角化细胞生长因子的获得及植物表达载体的构建

从鼠肺中提取RNA,设计相应的引物,经RT PCR扩增出角化细胞生长因子cDNA序列;插入pMD18 T载体,经DNA测序证实为KGF基因.将KGF基因经酶切后连接于植物CaMV35S启动子和NOS终止子之间,单酶切插入pBI1301植物双元表达载体,转化大肠杆菌,阳性克隆提取质粒后转化农杆菌EHA105,实现KGF植物表达载体的构建,为KGF的进一步研究奠定基础.