地高辛标记探针原位杂交组织化学技术及其应用

地高辛标记原位杂交组织化学技术作为一种高效、方便、安全的原位杂交方法被广泛地应用在生物学研究的各个领域,本文论述了地高辛标记原位杂交技术的原理、步骤和应用。     

地高辛标记cDNA探针检测植物谷胱甘肽过氧化物酶基因表达及方法研究

本文利用RT-PCR和PCR技术制备地高辛标记的谷胱甘肽过氧化物酶(ATGPX3)cDNA探针,分别进行DNA和RNA斑点和印迹杂交分析.通过调整杂交液组分的浓度和增加10%硫酸葡聚糖的方法,改进杂交反应.实验结果表明,改良的方法不仅提高了杂交效率,而且明显检测到RNA杂交印迹反应.另外,利用地高辛标记cDNA探针技术也检测到了植物激素ABA诱导的ATGPX3基因的表达,同时证明了该方法可以用来检测植物基因的表达.     

甘蔗SPSⅢ内含子地高辛探针的制备及检测

以甘蔗SPS基因选择性剪接保留的内含子6,7,8片段为靶序列,利用PCR扩增技术分别制备出3种地高辛标记的SPS内含子探针:SPS-intron 6探针167 bp,SPS-intron 7探针93 bp和SPS-intron8探针175 bp,并通过斑点杂交实验表明这3种探针灵敏度高,都能检测到pg级的靶核酸,且特异性好,阴性对照实验显示无杂交信号.     

硫化铅纳米颗粒标记DNA电化学探针的研究

在水溶液中合成了表面具有自由羧基的硫化铅(PbS)纳米颗粒，以乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)为偶联活化剂，将其标记于人工合成的5’端氨基修饰的寡聚核苷酸(ODN)片段上，制备成PbS纳米颗粒标记DNA探针．在一定的条件下，使其与固定在玻碳电极表面的待测DNA序列进行杂交反应，利用阳极溶出示差脉冲伏安法间接测定Pb(Ⅱ)的量，从而实现对互补、非互补DNA片段的识别和电化学检测．同时对该探针的稳定性、选择性进行了讨论。     

地高辛标记cRNA探针原位杂交检测大鼠脑NMDAR—L mRNA

采用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｄｉｇ）标记神经递质受体ＮＭＤＡＲ－Ｌ ｃＲＮＡ探针技术进行原位杂交，研究了Ｗｉｓｔａｒ新生大鼠脑神经细胞ＮＭＤＡＲ－Ｌ的基因表达。光学显微镜观察结果显示，大脑皮层、海马等区有明显的ＮＭＤＡＲ－Ｌ ｍＲＮＡ表达，胞浆着蓝色，胞核不着色，背景浅谈，反差显著。实验结果表明地高辛标记ｃＲＮＡ探针能快速、准确地检测出ＮＭＤＡＲ－Ｌ ｍＲＮＡ，为进一步研究这一拟受体在脑中表达和分     

电泳在核酸纳米探针中的研究进展

近年来,核酸纳米探针的应用日益广泛,核酸纳米探针的分离表征手段的研究也得到了迅速发展,其中发展最快、应用最多的是电泳法,该方法已成为研究核酸纳米探针表面电荷和表面形态表征的主要手段之一。文章主要介绍了凝胶电泳法分离核酸纳米探针的原理,以及表面电荷对电泳分离过程的影响,评述了电泳方法在核酸纳米探针表征中的应用,并对前景进行了展望。     

基因组探针非试剂盒标记系统中DNase I用量优化

用10 U的DNA Polym eraseⅠ,一个跨度达百万倍的DNaseⅠ量,在15℃分别标记了1μg甘蓝型油菜中油821的基因组DNA,发现DNaseⅠ用量为0.1 U时,10 m in后就可获得较好的探针标记效果.DNase I用量为0.01 U时,标记2 h就显示较深的颜色.随着DNaseⅠ用量的降低,标记时间需要相应地延长.其用量超过1 U时,无法获得较好的探针标记效果.综合考虑DNaseⅠ用量及标记时间,DNase I用量为0.01 U、标记时间为3~7 h获得的标记效果最佳.     

生物素标记核酸探针杂交检测灵敏度的比较研究

用Biotin-11-dUTP进行缺口翻译缺备生物素标记的人β-珠蛋白基因探针并用该探针进行了斑点杂交，硝酸纤维素膜印迹杂交 及琼脂糖凝胶直接染交方法学比较，结果表明：经ABAP法显色后，上述三种杂交法中，DNA最低可检测量依次为5，10，50pg，以斑点杂交法最灵敏。     

微生物蛋白质组学研究中的二维凝胶电泳技术

二维凝胶电泳（two—dimensional electrophoresis,2-DE）是蛋白质组研究的核心技术,由于在蛋白质组学研究中的重要作用近年来备受关注。对在微生物蛋白质组学研究中的二维凝胶电泳技术的原理、主要步骤、应用、面临的问题和未来展望进行了概述。     

Comparative Studies on Preparation of Large Plant DNA Fragments by Pulse Field Gel Electrophoresis

The preparation of large plant DNA fragments is extremely important to the construction of large insert DNA libraries (YAC, BAC, PAC and TAC). Although several techniques have been developed in each step of large plant DNA fragments preparation, the whole processing remains complicated and difficult. Based on authors‘ research experience and the recent worldwide development in this field, the following aspects are discussed in this paper: techniques of plant high molecular weight (HMW) DNA purification by pre-electrophoresis, the optimal conditions for the partial digestion of the HMW DNA by HindⅢ, the isolation effects of of large plant DNA fragments (100-400 kb) with different parameters of pulse field gel electrophoresis (PFGE), and the recovery of large DNA fragments. Through comparative studies, the advantages and disadvantages of each technique are discussed and some recommendations are proposed for preparing high quality large plant DNA fragments. The suggested techniques have been used in preparing the large DNA fragments of maize, rice, moss, laver, sea tangle and peach, and similar resuits are obtained among all the materials. This paper only reports the results using maize as material.     

应用Digoxigenin标记的cDNA探针检测香蕉束顶病毒

用非放射性的Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的１１－ｄＵＴＰ取代３２Ｐ标记的ｄＡＴＰ或ｄＣＴＰ，标记克隆的ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂｃＤＮＡ，制备成探针．通过核酸斑点杂交对粗提取的ＢＢＴＶ，ＢＢＴＶ－ＤＮＡ，感染ＢＢＴＶ的香蕉植物的拟茎，球茎处的组织，新生叶片以及成熟后的叶片进行了检测．结果表明：ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１ｃＤＮＡ探针特异性强，不与ＣＭＶ—ＲＮＡ、无毒香蕉组培苗提取的核酸发生杂交反应；仅与粗提ＢＢＴＶ、ＢＢＴＶ－ＤＮＡ、ＢＢＴＶ侵染的香蕉组织的核酸提取物发生杂交反应．此探针灵敏度高，可检出含有ＢＢＴＶｃＤＮＡ－１０．５ｋｂ的质粒ＤＮＡ的最小量为１０ｐｇ；测定感病香蕉植株的拟茎汁液的最高稀释度可达１∶１２８，相当于０．４ｍｇ病蕉组织中的病毒含量．测定同一病株不同部位的结果表明，ＢＢＴＶ在植物体内的分布不均匀，拟茎处组织中病毒含量最高，球茎处的组织以及新生叶片中的病毒含量次之，成熟后的叶片中的病毒含量最低     

紫外辐射诱导牡蛎细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测

以牡蛎为研究对象,建立了水产动物DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测方法.分别以20W紫外灯距离30 cm照射牡蛎血液细胞30、60和120 s,然后用单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA的损伤.结果表明:未照射的细胞未受损伤,在电场中核DNA几乎不泳动,染色后呈圆形的荧光团,无拖尾现象.紫外照射后细胞核DNA均不同程度受损,且拖尾率、尾长、尾矩、Olive尾矩等指标值均随着照射时间加长而增加,DNA损伤程度与紫外照射时间之间存在明显的时间效应关系.研究结果为我国海洋环境中辐射防护研究和辐射毒理学检测提供新的研究方法和思路.     

不同激活剂条件下油藏内源微生物激活过程中DGGE分析

在对胜利油田沾3区块油藏状况分析的基础上,模拟地层高温高压的条件利用分子生物学技术研究了不同激活剂对内源微生物的激活效果.实验分别以葡萄糖、蔗糖、玉米浆、淀粉作碳源,以油井产出水和注入水作为研究对象,进行微生物的激活优化.结果表明,激活以后水样中微生物种群发生了明显变化,以葡萄糖为碳源激活效果尤为突出.另改变葡萄糖的浓度对激活效果进一步研究,结果表明,当葡萄糖的浓度为5 ～ 7.5 g·L-1时较为合适,细菌密度能达到107 cell·mL-1.产出水的激活效果比注入水要好.     

基于单细胞凝胶电泳法的不同烷化剂导致DNA损伤的比较研究

从单细胞水平考察单官能团和双官能团烷化剂引起DNA损伤的差异.采用单细胞凝胶电泳法检测并比较单官能团烷化剂甲基亚硝基脲与双官能团烷化剂尼莫司汀在不同浓度下对DNA的损伤情况.研究结果表明药物浓度与彗星尾部DNA含量之间存在线性关系.为了检测DNA交联损伤,选择加入断裂剂作为对照,结果显示双官能团烷化剂尼莫司汀能引起显著的DNA交联.本文从细胞毒性作用和DNA损伤水平考察了烷化剂的毒性,为阐明烷化剂的致癌和抗癌机制提供理论基础.     

基于正独立式机械双流传动的AMT选换挡执行机构

设计正独立式机械双流传动装置AMT系统的选换挡执行机构,提出其设计方法及设计流程,通过实验验证设计的合理性.对正独立式机械双流传动装置换挡过程进行运动学、动力学研究,计算出传动装置的换挡力,并结合整车对换挡时间的要求,初选选换挡执行机构的选位、换挡油缸的参数进行计算,最终得到选换挡执行机构的设计参数.台架实验及实车试验测定,执行机构的选位、换挡时间与理论计算的选位、换挡时间吻合.验证了选换挡执行机构设计的合理性,同时验证了在正独立式机械双流实际传动装置上应用AMT技术的可行性.     

琼脂糖电泳凝胶中回收微量DNA片段的新方法

对现有的DNA片段回收方法进行了改进.琼脂糖凝胶中目的DNA片段条带切割后,浸入适量的TE溶液(0.2～0.4 mL/g 琼脂糖胶),在37 ℃水浴保温15 min,以溶出凝胶中的DNA,利用相应的引物对浸出的微量DNA样品进行与原PCR反应相同条件下的PCR扩增,直接用75 %乙醇沉淀后,适量TE溶解得到回收的目的DNA样品.此法回收的DNA片段可用于分子克隆,特别是适用于TA载体的克隆与测序,适合大批量微量样品的准确回收,防止了因试剂盒回收造成的微量DNA片段的丢失.     

分支DNA探针法检测21例丙型肝炎血清病毒RNA

目前主要依赖检测丙型肝炎抗体来确定对丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染的诊断,但它不能反应机体是否有活动的病毒血症。分支DNA探针法应用合成的DNA分子与靶HCV—RNA特异性的杂交,形成RNA—DNA杂交体,用dioxetane作为底物与化学发光物结合,通过测定其发光强度可直接检测血清HCV—RNA的含量。本文测定21例慢性活动性丙型肝炎血清。HCV—RNA最低值为0.66Meg/ml;最高值为58Meg/ml,21例中86％的数值分布在0.66Meg/m-12Meg/ml的范围内。此方法cutoff值为0.5Meg//ml。我们所测定的21例均高于cutoff值。此方法操作简便,特异性强。为临床丙型肝炎治疗的监测及疗效的判断提供了重要的依据。     

荧光素-酚藏花红能量转移体系用于测定DNA

以能量转移体系作为DNA荧光探针是测定DNA的新方法,该方法灵敏、快捷、重现性好,其DNA的线性范围为0.067~11.73μg.mL-1,检出限为0.054μg.mL-1,对0.80μg.mL-1的DNA进行了10次测定,相对标准偏差为0.49%。该荧光探针用于混合样品的测定,结果令人满意。