小鼠肝肿瘤细胞原位灌注分离培养方法的建立

摘要: 目的建立一种有效分离小鼠肝肿瘤细胞的原代培养方法,为肝癌发生发展的机制研究提供有效的实验手段。方法以9 月龄H-ras12V 转基因肝癌小鼠为实验材料,采用传统的小鼠肝细胞原代培养的灌注分离法,并对其进行改进,即在灌注的同时,用剪刀剪去肿瘤表面阻塞的血管和组织,疏通灌注液流,达到有效消化肿瘤组织的目的。对用此改良灌注法分离的肝肿瘤细胞和肿瘤周围组织细胞进行成活率计数,并进行后续的原代细胞培养,观察第3、5、7 天的细胞生长状态和形态特征。结果通过对传统的灌注分离肝细胞法进行改良,分离的肝肿瘤细胞成活率由未改良前的10%提升到40%。原代培养的结果表明,分离的肝肿瘤细胞与肝肿瘤周围的正常肝细胞的形态和随时间延长的凋亡变化状态没有显著差异。结论改良的灌注法能够有效的分离小鼠肝肿瘤细胞,并显著提高其存活率和细胞质量,可用于后续的原代细胞培养并开展相关的实验。另外,本文对改良灌注法的详细叙述也为相关的科研工作者提供了切实可行的操作规程。     

原代肝细胞的分离培养及其在药物研发中的应用

原代肝细胞分离培养无需特殊装置,易于开展,且排除了血液、神经、体液等因素的影响,生长环境易于人工严格控制。利用原代肝细胞进行体外实验,与其他体外及体内实验方法相比,有自身显著的优点。原代肝细胞模型是药效筛选、毒性筛选、药物代谢与生物转化、药物相互作用、药物致癌性检测的理想模型,为新药研究提供重要的参考资料,提高了新药研发的效率。随着实验方法和实验技术的不断成熟,原代肝细胞在药物研发中将有着更加广泛的应用。     

PP2A Cα敲除小鼠心肌细胞模型的构建

体外构建PP2A Cα敲除的原代小鼠心室肌细胞模型.选择性地将雄性PP2A Cαfl/fl,Cre/-小鼠与雌性PP2ACαfl/fl,Cre/-小鼠交配.新生小鼠心脏经胰酶消化后差速贴壁获得原代小鼠心室肌细胞,用带有Cre的腺病毒侵染心肌细胞,经荧光显微镜观察和Western-blot检测,分析PP2A Cα的敲除效果.将基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的雌雄小鼠进行交配,得到其同样基因型的后代,进而可获得足量基因型为PP2A Cαfl/fl,Cre/-的原代小鼠心肌细胞.用带有重组酶Cre的腺病毒侵染细胞48 h后,可见带有绿色荧光的心肌细胞;Western-blot检测显示,PP2A Cα在Cre腺病毒侵染的心肌细胞可下调60%～80%.本研究成功建立了PP2A Cα敲除的原代小鼠心肌细胞模型.     

孔雀石绿对小鼠肝脏生理功能的影响

对孔雀石绿在哺乳动物体内蓄积后对其肝脏的影响进行研究.将昆明种小鼠随机分为四组:正常组、孔雀石绿5、10、20 mg/(kg.d)组,灌胃,正常组给予同体积生理盐水.30 d后,测定小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及碱性磷酸酶(AKP)的变化、流式细胞仪检测小鼠肝细胞线粒体膜电位的变化、激光共聚焦显微镜检测肝细胞钙离子质量浓度的变化.与正常组相比孔雀石绿组小鼠血清中ALT、AST、AKP活性有所升高、肝细胞线粒体膜电位明显降低、肝细胞钙离子(Ca2+)质量浓度升高,且随着孔雀石绿量的加大,损伤程度增加.结果显示孔雀石绿在小鼠体内累积后可以通过影响肝细胞内酶活性、肝细胞线粒体膜电位及肝细胞内钙离子质量浓度的改变而导致肝脏损伤.     

牛胎盘中肝细胞生长因子的生物学特性

实验研究来源于牛胎盘的肝细胞生长因子的生物学特性。将新鲜牛胎盘匀浆后经盐析、亲和层析、超滤和离子交换层析可以纯化到一种肝细胞的生长因子。实验采用＾３Ｈ－ＴｄＲ拓入细胞ＤＮＡ的量来表示肝细胞生长因了促进细胞ＤＮＡ合成的作用，用液体闪烁计数来探讨＾３Ｈ的放射性。结果表明：该因子对原代培养的大鼠肝细胞、肾细胞的ＤＮＡ合成都有刺激作用，而且也能刺激原代培养的人胎肝细胞的ＤＮＡ合成。但对传代培养的小鼠腹水Ｓ     

培养原代小鼠组织细胞检验细胞实验室技术操作规程

目的通过培养小鼠原代组织细胞,检验本科室己建立的一套细胞实验室技术操作规程能否满足细胞培养要求。方法培养小鼠原代成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、肺部细胞、脑部细胞、骨髓间充质细胞和胚胎成纤维细胞。计算原代培养成活率、传代成活率、冷冻及复苏成活率。结果成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞、肺部细胞、脑部细胞、骨髓间充质细胞、胚胎成纤维细胞原代培养成活率分别为89%、96%、100%、100%、100%、80%、100%和90%;传代成活率分别为76%、93%、100%、92%、100%、66%、80%和92%;冷冻及复苏成活率分别为100%、100%、100%、100%、100%、100%、100%和100%。结论通过计算KM小鼠8种组织细胞原代培养、传代、冷冻与复苏的成活率,证明现有的细胞室技术操作规程基本上能够保证成功培养出常规原代细胞,并能传代、冷冻和复苏。     

原代小鼠卵巢上皮细胞TP53基因敲除及其生物学特征变化

目的 利用CRISPR/Cas9慢病毒载体系统建立小鼠原代卵巢上皮细胞TP53基因稳定敲除细胞系,分析细胞增殖、细胞周期、克隆形成以及细胞转移侵袭能力的变化。方法 构建LentiCRISPRv2-sgRNA TP53基因敲除质粒,用293FT细胞进行慢病毒包装,转导小鼠原代卵巢上皮细胞,嘌呤霉素筛选出稳定敲除细胞系,进行PCR、蛋白免疫印迹以及免疫荧光鉴定。细胞增殖、细胞周期变化、克隆形成、细胞迁移侵袭能力分别用MTT、流式细胞分析、单层培养以及Transwell小室进行测定。结果 TP53基因敲除小鼠原代卵巢上皮细胞中P53表达缺失;TP53敲除引起细胞迅速增殖,DNA合成加速,克隆形成以及迁移侵袭能力增强。结论 获得了原代小鼠卵巢上皮细胞TP53基因稳定敲除细胞系,细胞生物学特征明显改变。     

ZnO@(Fe_3O_4/ZnS:Mn~(2+))复合空心药物载体的生物相容性研究

通过自组装的方法制备ZnO@(Fe_3O_4/ZnS:Mn~(2+))复合空心药物载体,考察ZnO@(Fe_3O_4/ZnS:Mn~(2+))复合纳米微球对HepG2、HK2和大鼠原代肝细胞活性的影响,同时考察ZnO@(Fe_3O_4/ZnS:Mn~(2+))复合纳米微球在ICR小鼠体内对小鼠脏器比、血生化指标的影响.结果表明,ZnO@(Fe_3O_4/ZnS:Mn~(2+))复合纳米微球具有很好的生物相容性.     

人脐静脉内皮细胞培养液的选择

目的:筛选出人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代、传代最适培养液.方法:0.02%II型胶原酶灌注脐静脉消化15min获得细胞,用不同的培养液培养.24h后观察细胞贴壁状况,细胞计数法得到贴壁细胞数量;内皮细胞标志性蛋白vWF进行细胞鉴定.传代培养后,用MTT法比较不同培养液对HUVECs活力的影响.结果:用含ECGS、20%FBS的ECM组进行原代培养,可获得贴壁细胞数量最多的HUVECs,且与其他组间有显著差异;用含30ng·mL-1 VEGF165、10%FBS的M199进行传代培养,HUVECs活力较ECM组无明显差异.结论:HUVECs原代、传代培养分别选用优化后的培养液,既保证原代HUVECs的质量和数量,又使传代培养成本降低60.8%.     

油酸诱导花鲈肝细胞脂肪沉积模型的建立及二甲双胍对脂肪沉积的影响

为研究鱼类脂肪肝的发生机制及控制方法,以及研究二甲双胍对花鲈肝细胞脂肪沉积的缓解作用,以花鲈原代肝细胞为研究对象,通过油酸诱导的方法建立肝细胞脂肪沉积模型,用不同浓度的油酸(0、0. 2、0. 4、0. 8 mmol/L)培养花鲈原代肝细胞,并测定细胞内甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及上清液谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,确定油酸适宜浓度。同时,利用此模型观察二甲双胍对脂肪沉积的影响。研究结果显示:0. 4 mmol/L油酸诱导培养肝细胞48 h,肝细胞TG及TC含量显著高于对照组,上清液AST、ALT与LDH活性显著高于对照组,细胞内有明显脂肪滴,且此时肝细胞存活率较高,肝细胞变形较多。在此基础上,观察研究二甲双胍对花鲈肝细胞脂肪沉积的影响,设对照组、油酸和二甲双胍组,培养肝细胞48 h,收集细胞和上清液。结果显示,二甲双胍可显著降低肝细胞TG、TC的含量,以及上清液AST、ALT与LDH的活性。综上所述,用含0. 4 mmol/L油酸培养基培养肝细胞48 h可建立肝细胞脂肪沉积模型,二甲双胍可缓解油酸引起的肝细胞脂肪沉积。     

纬编过程中织针对三角座冲击力的测试

本文采用通用型式的压电加速度计,检测织针对三角座(不同升角的挺针三角)冲击加速度峰值,并通过估算得出织针对三角的冲击力。本实验为提供研究本课题一种新的简便测试方法。     

黑色素瘤模型的建立与评价

为了快速有效地进行在体药物筛选,研究了以小鼠黑色素实体瘤组织中的原代细胞构建黑色素瘤模型的方法。从荷黑色素瘤小鼠的组织中提取原代肿瘤细胞,与体外培养的B16细胞通过皮下注射分别植入两组C57BL/6小鼠体内,考察两组小鼠肿瘤显现时间和生长速度。结果表明：当接种浓度为5.0×10⁶个/ mL、每只0.2 mL时,小鼠黑色素瘤原代细胞和体外培养的B16细胞成瘤率分别为100%和80%,且小鼠右前肢肿瘤(大小约4 mm³）出现时间分别约在第3天和第8天。紫杉醇对两种模型的初步评价显示,与体外培养的B16细胞模型相比,原代B16细胞模型是体内筛选和评价特定化合物抗肿瘤活性的一种可行而有效的方法,成瘤时间较短、成瘤率高,所得实验数据误差也较小。模型的建立为相关药物评价模型的开发研究提供了一条可借鉴的新途径。     

超微仿生扑翼飞行器压电双晶驱动器仿真与优化

为了设计高性能的超微仿生扑翼飞行器压电双晶驱动器,提出了结合正交试验与压电场、应力场等多物理场直接耦合有限元法,对微驱动器的结构、几何参数进行优化.根据正交试验表设计有限元仿真分析试验,对试验结果进行极差分析,得到各影响因素对驱动器弯曲角度指标影响的主次顺序,并获得了提高压电双晶片驱动器性能的最优化方案.仿真结果表明,多物理场优化方法大幅度提高了扑动角度,满足超微扑翼飞行器的设计要求.     

酿酒酵母的连续复合诱变及其突变株的快速筛选

为了获得高产的工业用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株,利用己烯雌酚(DES)和UV对酿酒酵母菌QD进行连续复合诱变,采用改进的发酵小管集气法结合乙醇定量测定来进行突变株的筛选,并与常规复合诱变及筛选方法进行比较.结果表明:连续复合诱变的正向突变率最大值为18.9%,与常规诱变方法的最大正向突变率15.6%相比提高了21.2%,说明运用该诱变方法能获得较高的正向突变率;改进的筛选方法可以快速筛选出目的突变株,同时,获得了一株高产乙醇的突变株,在甘蔗汁发酵培养基中其乙醇产量达到9 720 mg/100 mL,比常规诱变方法筛选到的突变株乙醇产量(9 170 mg/100 mL)高出6.0%;与常规诱变方法相比,连续复合诱变方法不仅能够得到较高的正向突变率,而且能够获得更加高产的突变株.     

云南松松针中莽草酸的含量测定

目的:建立HPLC法测定云南松松针中莽草酸含量的方法.方法:采用Phenomenex Gemi-ni-NX 5μC18110A(4.6mm×250mm)色谱柱,以甲醇∶1%磷酸水溶液(15∶85)为流动相,检测波长215nm,流速1mL/min,柱温为30℃.结果:莽草酸进样量在0.101 2～2.024μg范围内线性关系良好(r=0.999 7),样品的平均回收率为99.76%,RSD为0.89%(n=9).结论:本法操作简便、快速、分离效果好、稳定性高、重现性好,可用于松针中莽草酸的含量测定.     

蒙古长爪沙鼠颌下静脉丛真空采血法探讨

摘要: 目的 探讨蒙古长爪沙鼠( Mongolian gerbil) 颌下静脉丛真空采血的技术与方法,提高蒙古长爪沙鼠实验的成 功率。方法 选取 40 只蒙古长爪沙鼠,麻醉后将静脉输液针刺入颌下静脉丛血管取血。结果 成功获得沙鼠静 脉血,每只沙鼠的采血量可达 0. 3 － 0. 6 mL。结论 此方法可多次重复采血,血液标本质量高,创伤小,是一种简便、安全、采血量多的采血方法。     

凸二次规划的广义互补主元算法及在组合投资中的应用

提出求解二次规划的一种算法－－广义互补主元算法,仅用行初等变换,无须人工变量,也不需要选择出其变量,在同一表格下可求出最优解,简化了Ｌｅｍｋｅ主元算法,该方法易于操作,在组合投资的若干优化模型中得到应用。     

基于模糊图像相关的MEMS动态测量技术

 在基于视觉的微机电系统(MEMS)谐振器动态参数测量中,由于模糊图像合成技术对摄像机采集速率要求不高,且能够得到较高的测量精度,因此在实际测量系统中具有广阔的应用前景。在研究模糊图像相关性的基础上,提出了一种基于模糊图像相关性的MEMS平面运动参数测量方法。该方法通过求取模糊图像一阶微分的自相关函数负峰的间距实现振幅的测量,算法在空域内进行,不受变换域分辨率限制,可以通过插值提高振幅测量精度。实验分析表明,图像中不同区域的相似纹理是产生干扰峰的主要原因,通过在振动方向对图像进行对比度增强,可以减小振动方向的纹理重复度。实验结果表明：该方法是可行的,能精确测量MEMS谐振器的动态参数,并且测量方法简单,只需采集一幅MEMS谐振器在振动稳定状态下的模糊图像即可进行测量,数据处理量小,有利于实现在线测量。     

经皮穿针外固定治疗高龄股骨粗隆间骨折48例疗效观察

在局麻和C臂X线监视下手法复位,采用5枚斯氏针经皮穿刺体外固定治疗高龄股骨粗隆间骨折48例,手术时间平均40 min.结果表明:48例术后随访3个月~5年,骨折均愈合,优良率达93.7%.该手术方式创伤小,时间短,安全可靠,患肢功能恢复快,是治疗高龄尤其身体条件差的粗隆间骨折的一种较好方法.     

苯基硼酸催化酰胺键构建方法研究

酰胺键是一种可表现出高生理活性的特殊结构,形成酰胺最理想的途径是羧酸与胺直接反应,但必须要在强热的条件下才可生成。为了解决此问题,研究了一种通过利用简单的芳基硼酸催化,在较为缓和的条件下使脂肪酸与伯胺直接缩合构建酰胺的方法,以苯乙酸与苄胺的直接酰胺化建立反应体系,对反应催化剂种类、催化剂用量、反应溶剂、反应时间以及反应温度进行了优化。结果表明：以氟苯为溶剂,苯硼酸为催化剂,先在回流温度下处理有机酸1 h后,再加入脂肪胺继续反应12 h,在此最佳反应条件下,可获得对应酰胺的收率在80%以上,采用¹H NMR和¹³C NMR对所得产物的结构进行了表征。方法操作简单,产物易于纯化,是一种新的制备酰胺类化合物的有效方法。