木薯醇腈酶(HNL)cDNA在大肠杆菌中高效表达的初步研究

将编码木薯醇腈酶（HNL）cDNA克隆到原核表达载体pBV220，构建了大肠杆菌（Escherichia coli）中表达质粒pBV220-HNL．含重组质粒pBV220-HNL的大肠杆菌D145α菌株经温度诱导后，其表达产物以包涵体形式存在．SDS-PAGE分析及酶活测定的结果表明木薯HNL cDNA在大肠杆菌中成功表达．     

丝瓜ACC合成酶的原核表达、分离纯化及性质鉴定

将构建成功的丝瓜ACC合成酶cDNA的重组质粒, 转化为大肠杆菌BL21（DE3）, 经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后得到特异性高效表达, 表达蛋白以包涵体形式存在. 包涵体经洗涤和Zn^2＋螯合柱层析, 得到纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白分子量为55 000的单一蛋白带. 经活性分析, 该酶最适pH值为8.5, 米氏常数（K_m）为44.2　μmol/L.     

人纤溶酶原Kringle5基因的克隆、表达及产物纯化和性质鉴定

根据人纤溶酶原的cDNA序列,利用PCR技术获得人纤溶酶原kringle5结构域的基因,并将其克隆至表达质粒pET25b( )中。重组载体pET25b（ ）/kringle5转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,在12kD处可见明显的表达条带,表达产物大部分以无活性的包涵体形式存在。包涵体经过体外变复性,SP-SepharoseFF离子交换柱一步纯化,15%SDS-PAGE鉴定考染一条带,纯度达95%以上。所得到的目标蛋白明显的抑制bFGF诱导的牛毛细血管内皮细胞增生。     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

定点突变内皮抑素Zn2+的结合位点及突变基因的克隆表达

从人胚肝组织中提取总RNA, 以逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法获得人内皮抑素编码序列, 采用定点突变技术将His2和His4双突变为Leu2和Val4. 将突变基因cDNA插入含有T7启动子的质粒pET-28b中构建表达质粒pMendo, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选表达菌株BL21-Mute, 表达菌株经IPTG诱导后以包涵体方式产生大量内皮抑素突变蛋白. SDS-PAGE分析表明, 表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白质的30%. 复性、 纯化的内皮抑素突变蛋白纯度达到98%, 失去抑制人脐静脉内皮细胞增殖的活性.     

白喉毒素突变体CRM197原核表达载体构建及其蛋白表达

将合成的CRM197基因片段克隆到表达载体pBAD-DEST49中,转化到大肠杆菌菌株（ATCCMC1061）．经阿拉伯糖诱导,CRM197获得高效表达．目的蛋白主要以包涵体形式存在,变性、复性后经DEAE阴离子交换后获得高于95％纯度的CRM197样品．用该样品做Westernblotting鉴定后,能得到单一的特异性条带．本实验的表达策略,为CRM197进一步生产及应用奠定基础．     

拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备

在拟南芥花药发育过程中,MYB家族转录因子TDF1在调控绒毡层发育及后期功能上起到关键的作用．利用PCR方法扩增TDF1基因并克隆到原核表达载体pET-32a．将表达载体TDF1-pET32a转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG成功诱导表达了分子量约为56KD的TDF1融合蛋白．该融合蛋白主要以包涵体形式存在,分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗原免疫家兔．制备出的多克隆抗血清经ELISA测定效价为1：2560,Westernblot检测表明该抗血清与TDF1融合蛋白识别良好．TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究TDF1在花药发育中的功能．     

高频等位基因HLA-A*1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

人肿瘤坏死因子受体Ⅰ(hTNFRⅠ)基因死亡域在大肠杆菌中的表达

将人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（ｈＴＮＦＲＩ）死亡域基因克隆在氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）的后面,构建成重组表达质粒ｐＬＴ１０ ＣＡＴＬＤｄ．该融合蛋白基因转化大肠杆菌后发酵,ＩＰＴＧ诱导２ ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定ＣＡＴＬＤｄ 蛋白质的分子质量为３９ ｋｕ．Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹实验进一步作了鉴定．表达产物为包涵体．ＣＡＴＬＤｄ 蛋白质经Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 柱层析后纯度大于９５％ ．     

GST融合蛋白包涵体纯化方法的探索

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

细胞毒性T细胞抗原4胞外结构域的高效表达与纯化

目的:获得细胞毒性T淋巴细胞相关分子4胞外结构域(exCTLA4)在大肠杆菌中高效表达的条件,并纯化获得高纯度的重组蛋白.方法:构建原核表达质粒pET28a-exCTLA4并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中,通过改变诱导物IPTG浓度、细菌培养温度和时间,获得了exCTLA4的最佳表达条件.收集最佳诱导条件下表达exCTLA4的菌体,将菌体超声破碎后,离心分离exCTLA4包涵体,用低浓度尿素(2mol·L~(-1))洗去大部分背景蛋白后,再用高浓度尿素(8mol·L~(-1))溶解包涵体,进一步用镍离子亲和层析方法得到高纯度exCTLA4.结果:构建了表达载体pET28a-exCTLA4,获得了exCTLA4在Transetta(DE3)中的最佳诱导条件,即在1mmol·L~(-1) IPTG、25℃下,诱导6h能得到最佳表达,但重组蛋白以包涵体形式存在.通过纯化exCTLA4包涵体及进一步的镍离子亲和层析获得了高纯度的目的蛋白,Western blot鉴定为CTLA4.结论:获得了exCTLA4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件和纯化方法及步骤,为该蛋白的应用奠定了基础.     

Cry1Ab/Ac抗虫基因克隆与原核表达

针对转基因水稻TT51-1插入的Bt基因,扩增全长序列并克隆至pGEM-T载体.测序验证后利用HindⅢ与BamHⅠ双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体.转化重组构建的pET-28a-cry至BL21(DE3)宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下获得以包涵体形式表达的目的蛋白.经SDS-PAGE凝胶回收法获得相对分子质量约7.1×104的目的蛋白rCRY,为转基因作物检测新方法的开发提供了物质基础.     

尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化

根据 GenBank 中 NDP kinase 的基因序列,采用生物信息学方法将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化,合成 NDP kinase 基因,构建原核表达载体 pET28a-NDP kinase 并酶切鉴定其序列,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,重组产物采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.经密码子改造和二级结构优化后 NDP kinase 基因长度为490 bp,其编码蛋白理论分子量为21.5 kDa,重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中该基因经 IPTG 诱导可高效表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21.5 kDa,其单一蛋白纯度达95;以上.本研究成功构建了尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸酶（NDP kinase）基因的 pET28a 原核重组质粒,为进一步研究 NDP kinase 在尘螨疫苗免疫治疗中的作用机理提供了基础.     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

枯草芽孢杆菌的ade基因在大肠杆菌中的MBP融合表达及活性鉴定

扩增了枯草芽孢杆菌的ade基因, 重组入载体pMal-c2x中, 构建了麦芽糖结合蛋白（MBP）融合蛋白的表达体系. 通过IPTG诱导表达, 用MBP亲和层析法, 纯化该融合蛋白（104 700）, 并通过SDS-PAGE对表达及纯化结果进行检验, 对其酶学性质进行了初步研 究. 分析结果表明: 该融合酶蛋白具有显著的腺嘌呤脱氨酶活性, 证明了ade基因是枯草芽孢杆菌中编码腺嘌呤脱氨酶的基因.     

蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14中III型聚酮合酶的表达、纯化及生物信息学分析

竹红菌素是我国特有的一类苝醌类光敏色素,在开发新型抗肿瘤抗病毒药物、光敏活性农药及新型光电转换材料等方面应用前景广阔.聚酮合酶（ Polyketide synthase,PKS）是合成竹红菌素的一种关键酶,通过全基因组测序及分析发现在Shiraia sp. Slf14中存在一个III型聚酮合酶基因.利用RT-PCR技术,以其总RNA为模板,扩增得到目的片段,并成功构建表达载体pET-22b（+）-PKSIII,采用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,在大肠杆菌BL21（ DE3）中成功表达出了目的蛋白,SDS-PAGE结果显示表达重组产物分子质量约为43 kDa,与理论值一致,为III型聚酮合酶的催化活性研究提供理论依据.     

hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征

为获得hCuZn-SOD基因,根据GenBank中人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)基因碱基序列,设计扩增引物,用RT-PCR方法从人的肝细胞中克隆出hCuZn-SODcDNA序列,并将它插入pUCm-T载体中,经过DNA序列测定证实,该片段序列的一个碱基发生突变(与报道基因相比),引起其编码第116个氨基酸由G变为D.采用定向克隆的方法将hCu Zn-SOD的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-2T上,构建表达质粒pGEX-SOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析证实,经IPTG诱导,融合蛋白GST-SOD获得高效表达.破碎菌体、上清经谷胱甘肽亲和层析初步纯化后,得到纯度达90%的目的蛋白.活性实验表明,GST-SOD具有生物活性.     

甘薯储藏蛋白(sporamin)A基因在大肠杆菌中的表达研究

利用基因重组技术,将ＰＣＲ扩增获得的甘薯储藏蛋白Ａ基因的成熟肽编码区序列,插入到高效表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＢ中,构建成重组表达质粒ｐＴＨＳＰＯ－Ａ,用限制酶切和ＰＣＲ分析均表明重组质粒与预期结果相符,用ＩＰＴＧ诱导重组质粒转化的大肠杆菌ＴＯＰ１０。菌体总蛋白经１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一个大小为１０ｋＤ的蛋白质带,其分子量比预期值小。     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结