人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法，用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A．从该蛋白编码序列中设计引物，以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段．将所得片段与pMDl8-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，从转化平板上挑出菌落，用碱裂解法提取质粒，通过PCR和酶切分析，筛选到阳性克隆，测序结果与文献报道结果一致．提取质粒，用BamHI和XhoI酶切，回收目的片段，分别克隆到原核表达载体pET28a（4-）和pGEX-6P-1中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）菌中，筛选出阳性克隆，构建了人扭转蛋白A原核表达载体．IPTG诱导该工程菌，培养并离心收集．SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达．     

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SWE2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21（DE3）表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化人大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Westernblot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。     

莱茵衣藻外源基因整合特征分析及蛋白表达

将衣藻表达载体pSP108转化莱茵衣藻细胞壁缺陷型藻株CC-400,通过接头PCR获得并分析阳性转化子中ble基因的侧翼序列发现:外源基因的插入位点呈现随机性,并且有些转化子中衣藻基因组和质粒序列发生断裂和重排.通过间接ELISA分析外源蛋白表达量,并结合外源基因整合状态时发现:在ble基因启动子核心区域缺失的阳性转化子中,ble可以利用自身基因启动子进行蛋白表达,但表达量相比使用质粒载体PSP108上RBCS2启动子的表达量要低;在部分启动子完整的阳性转化子中蛋白表达量低下,可能与衣藻基因组大片段的缺失相关.     

大麦醇溶蛋白基因片段克隆和RNAi植物表达载体构建

 为了降低啤酒大麦蛋白的含量,提高啤酒大麦品质,利用甘肃推广面积最大的品种甘啤4号为材料,克隆大麦醇溶蛋白基因保守区序列,构建RNAi表达载体。根据已知大麦醇溶蛋白基因保守序列设计一对特异性引物B2PF5′-CAACCATTTCCACAGCAACCACCAT-3′,B2PR5′-GAAAGATAGAGTAGACGATTGCACG-3′,采用PCR技术从甘啤4号大麦基因组中获得了1个349bp片段（GP4）。依据载体pHANNIBAL和pART27的结构,分别将GP4按所对应酶切位点正反向插入,利用热激法转化。结果分析显示,克隆出的片段与GenBank （NCBI）中醇溶蛋白基因核苷酸序列同源性高达92%,所构建成的RNAi表达载体pART27-pHAN-GP4中含目标片段。     

αB-晶状体蛋白CRYAB基因重组表达载体的构建及分子生物学鉴定

目的:构建人晶状体蛋白CRYAB基因与真核表达载体pIRES2-DsRed-Express的重组体,为研究人晶状体蛋白CRYAB基因的功能奠定基础.方法:根据人晶状体蛋白CRYAB基因的核苷酸序列,设计并合成分别带有酶切位点的引物,从pMD 18T-CRYAB基因克隆载体中扩增出CRYAB基因外显子片段,与载体pIRES2-DsRed-Express连接构建人晶状体蛋白CRYAB基因的表达载体,转化入大肠杆菌DH5α中.经抗生素筛选阳性克隆,通过酶切图谱分析、菌落PCR和测序鉴定所构建的表达载体.结果:构建的载体经PCR、酶切鉴定和测序证实插入方向正确,表达阅读框正确,载体构建成功.结论:重组人晶状体蛋白CRYAB基因表达载体的构建为研究CRYAB基因的功能及进一步研究先天性白内障的发病机制奠定了基础.     

人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究

以小鼠MAR（matrixattachmentregion）元件,牛β－酪蛋白（β－casein）基因5＇端2．0kb调控顺序,人凝血Ⅸ因子小基因（hFIXminigene）构建乳腺组织特异性表达载体,表达载体和质粒pSV－neo共转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,兔皮肤纤维细胞（RSF）和人胚肾上皮细胞（293细胞）．发现hFIX基因在CHO细胞中获得低水平表达,最高表达量为7．2ng／ml．在皮肤成纤维细胞中的表达量低于2ng／ml．在293细胞中没有表达．表达载体用stearylamine（SA）脂质体包埋后尾静脉注射哺乳期小鼠,hFIX蛋白在小鼠乳汁中表达水平高达87．34ng／ml．     

苜蓿花叶病毒复制酶基因全长cDNA植物表达载体的构建

将苜蓿花叶病毒中国分离株（Alfalfa mosaic virus Chinese isolate，AlMV-Ch）的复制酶P2亚基（90KD蛋白）基因的全长cDNA构建到植物表达载体pROK Ⅱ中，得到重组植物表达载体pAlMV-FL．     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。     

甜菜夜蛾多核壳型核型多角体病毒vp39基因的克隆与表达

参照苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV)衣壳蛋白基因vp39的序列设计引物,采用PCR技术扩增了甜菜夜蛾核型多角体病毒的约1．3kb片段,通过将片段亚克隆至原核表达载体pET-28构建出重组表达质粒pET-Se39,以pET-Se39转化E.coli BL21。经IPTG诱导后,SeMNPVvp39基因高效表达,SDS－PAGE分析显示表达产物的分子量为39KD,并且表达量在IPTG诱导4h达到最高水平。／     

反义PARP基因真核表达重组体的构建及其HeLa转化细胞系的建立

利用DNA体外重组技术将PARP基因cDNA部分序列反向克隆到真核表达载体pMAMneo上,构建成重组质粒pMAMneo－C1．4和pMAMneo－C0．3．将重组质粒pMAM－neo－C1．4转染HeLa细胞,经G418筛选,建成细胞系HeLa－C1．4－neo,Southern杂交结果表明,外源PARP基因cDNA部分序列已稳定整合到受体细胞基因组中,该细胞系的建立为研究聚ADP核糖基化作用在细胞内的功能打下了基础．     

Obtaining the transgenic poplars with low lignin content through down-regulation of 4CL

The antisense 4CL (4-coumarate: CoA ligase)gene was transformed into triploid Chinese white poplar(Populus tomentosa) mediated by Agrobacterium tumefaciens.PCR and Southern blot analysis indicated that antisense 4CLgene had been integrated into the genome of the transgenicChinese white poplars. The antisense gene had also beenexpressed, which was indicated by RT-PCR and Westernanalysis. Klason lignin content assay showed that repressionof 4CL expression could result in remarkable reduction oflignin content in transgenic poplars, with most reduction of 41.73% compared with that of wild type in this paper. Butthere is no significant difference in holocellulose content be-tween trans- genic and wild poplars. We considered that 4CLmight not be the metabolism control point between ligninand carbohy- drate biosynthesis. The stems of transgenicpoplars displayed red-brown color with different levels afterthe bark was peeled, while those of untransformed plantswere white. No visible differences in growth and developmentwere observed between transgenic and wild plants. Wiesnerreaction analysis of the transgenic plant stems with reducedlignin content exhibited red color, while that of untrans-formed plant was typically purple-red.     

肝片吸虫抗原基因转基因苜蓿再生的研究

用直接转化法，将构建有肝片吸虫保护性抗原基因FH3的植物表达载体pBI121-FH3,导入感受态的根瘤农杆菌EHA105；以重组的根瘤农杆菌为介导，用叶盘法转化苜蓿外植体，筛选得到抗Kan转化外植体；抗性外植体通过诱导丛生芽和诱导生根，再生出完整植株，提出植株总DNA进行Southern blot，结果表明，FH3基因已经整合入苜蓿基因组中。     

盐生杜氏藻(6-4)光裂合酶在大肠杆菌CPD缺陷株SY2中的功能鉴定

将盐生杜氏藻（6—4）光裂合酶基因Ds64PHR的编码序列构建到表达载体pET32a中,利用高效转化法将构建好的表达载体转入E．coli．CPD光裂合酶缺陷菌株SY2中,诱导表达（6-4）光裂合酶融合蛋白,对其功能进行验证．在含有Amp的LB平板上涂布相同数量的大肠杆菌,改变紫外照射强度、光照修复时间,统计最终的菌株存活率．经研究发现,在基因水平上,SY2中表达的盐生杜氏藻（6—4）光裂合酶具有修复紫外诱导损伤的功能,光照是修复功能实现的必需条件．     

转BADH基因玉米的获得及其耐盐性

利用花粉管通道技术将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因导入玉米，以提高玉米的耐盐性．对1286株转化玉米进行PCR检测，共有16株呈阳性，转化率为1．2％．Southern Blot进一步证明BADH基因已经整合到玉米基因组．将阳性植株的后代（T3）用含1.2％NaCl的Hogland营养液每日1次浇灌。14d后对玉米叶片的相对电导率和叶绿素含量进行测定．结果表明在同样的盐胁迫条件下．转基因植株所受到的盐伤害明显较对照植株轻，说明转入的BADH基因可以提高玉米的耐盐能力．     

人源CPP32基因表达对酵母细胞生长的影响

为研究人源ＣＰＰ３２基因的表达对酵母细胞生长的影响,了解其所编码的蛋白质在分子进行过程中的功能特性,将不原ＣＰＰ３２基因克隆到表达载体ｐＧＢＴ９中,得到重组质粒并命名为ｐＧＢＴ９／ＣＰＰ,再将其和对照质粒ｐ（ＧＢＴ９）分别转化到ＣＧ１９４５和ＨＦ７ｃ酵母细胞中,一定时间测定培养物的ＯＤ６００值并做出生长曲线。结果表明：诱导真核细胞程序性死亡的人源ＣＰＰ３２基因对不同种的酵母细胞的作用不同;转化到宿     

Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation

The graminaceous monocots, including the economically important cereals, seem to be refractory to infection by Agrobacterium tumefaciens, a natural gene transfer system that has been successfully exploited for transferring foreign genes into higher plants. Therefore, direct transfer techniques that are potentially applicable to all plant species have been developed using a few dicot and monocot species as model systems. One of these techniques, electroporation, uses electrical pulses of high field strength to permeabilize cell membranes reversibly so as to facilitate the transfer of DNA into cells. Electroporation-mediated gene transfer has resulted in stably transformed animal cells and transient gene expression in monocot and dicot plant cells. Here we report that electroporation-mediated DNA transfer of a chimaeric gene encoding neomycin phosphotransferase results in stably transformed maize cells that are resistant to kanamycin.     

Expression of two insect-resistant genes crylA ( b&c )/GNA in transgenic tobacco plants results in added protection against both cotton bollworm and aphids

The synthesized Bacillus thuringiensis insecticidal protein gene crylA(b&c) and the synthesized gene GNA, (the mannose specific lectin from snowdrop ( Galanthus nivalis)), tumefaciens have been inserted into plant expression vector pGW4BAI. Leave stripes of Nico-tiana tabacum var. K326 have been transformed with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harboring the plant expression vector. 28 kanamycin resistant tobacco plants have been obtained. PCR and Southern blot analyses show that the foreign crylA and GNA genes have been inserted into the genome of transformed tobacco plants. Haemagglutination assays show that GNA has a functional activity. Leaf disc bioassays against cotton bollworm ( H. armigera) show that the transgenic tobacco plants have a high insecticidal activity. The inhibition of aphid population in leaf disc bioassays against Myzus persicae shows that the fecundity of aphid on transgenic plants is lower than that on untransformed plants; the aphid population on the transgenic tobacco plants is 25%-70% that on untransformed tobacco plants. ELISA analysis of CrylA protein in tobcco leaves provides similar data to bioassay results. Through the two bioassays against H. armigera and M. persicae, several transgenic tobacco plants showing high insect-resistant activities to both pests have been obtained.