棉花SRAP遗传连锁图构建

应用SRAP标记构建棉花分子遗传连锁图, 作图群体为邯郸208与Pima90杂交产生的129个F₂单株. 筛选多态性较好的76个引物组合进行群体检测, 共得到285个多态性条带, 平均每个引物组合产生3.75个多态性条带, 最多的产生13条多态性条带. 对285个标记用MAPMAKER/EXP3.0构建连锁群, 237个标记进入39个连锁群(LOD ≥3.0) , 总长3030.7 cM, 覆盖整个棉花基因组的65.4%, 标记平均间距12.79 cM. 在整个连锁群中, 标记分布比较均匀, 没有聚集现象.     

海岛棉Gl2e显性无腺体基因的精细定位

Gl₂^e基因是控制棉花植株和种子无腺体的一个基因, 是低酚棉育种中一个重要的基因资源. 本研究利用陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉无腺体突变品系海1构建的1599个F₂单株, 对无腺体突变基因Gl₂^e进行了精细定位. 遗传研究进一步证明, 该基因是一不完全显性单基因. 结合本实验室的棉花海陆种间遗传连锁图谱, 利用SSR标记将Gl₂^e基因定位在CIR362和NAU2251b, NAU3860b, STV033之间, 遗传距离分别为9.27和0.96 cM.     

水稻不完全隐性卷叶主基因rl(t)的精细定位

利用奇妙香(QMX)为轮回亲本, 与卷叶珍汕97B(JZB)杂交并回交的BC₄F₂和BC₄F₃两群体为研究材料, 对卷叶性状进行了遗传分析, 并对卷叶基因进行精细定位. 遗传分析表明, 卷叶性状主要受1对不完全隐性主基因的控制, 命名为rl_(t), 并同时受到数量性状基因和或环境的影响. 利用500个SSR标记和新开发的15个InDel标记, 通过BSA法在卷叶DNA池和平展叶DNA池间筛选到8个多态性标记, 并用MAPMAKER/EXP3.0构建遗传连锁图. 基因定位方法采用复合区间作图法(CIM). 利用BC₄F₂分离群体将rl_(t)初步定位于第2染色体长臂, 位于标记InDel 112~RM3763之间, 两标记之间的遗传距离为2.4 cM, rl_(t)距离InDel 112约1.0 cM. 为精细定位rl_(t), 从BC₄F₂代经标记选择得到1个中度卷叶植株, 自交扩繁成855株个体的BC₄F₃代株系, 另发展4个新的InDel标记. 连锁分析表明, InDel 112.6和InDel 113位于标记InDel 112和RM 3763之间. 利用BC4F3株系中分离出的191个卷叶株和185个平展叶株, 将rl_(t)定位于InDel 112.6~InDel 113之间, 物理距离为137 kb. 对该区段进行了初步的侯选基因分析, 推测rl_(t)可能参与了microRNA(miRNA)系统对叶片发育的调控.     

水稻白穗突变体基因的鉴定和染色体定位

从一个水稻籼粳交F₆后代自然群体中获得1例白穗突变体, 其成熟植株基部少数叶片中脉呈现白色, 抽穗后穗粒内外稃和枝梗均表现白色. 用突变体作母本与一粳稻恢复系品种制7杂交, 获得一个F₂分离群体. 初步的遗传分析表明, 该突变属单基因隐性性状. 利用已定位的微卫星标记进行连锁分析, 发现该基因位于水稻第1染色体上. 进一步根据已完成的水稻基因组序列寻找微卫星位点, 连锁分析显示, 该基因位于微卫星标记SSR101和SSR63.9之间, 分别相距2.3和0.8 cM; 并与微卫星标记SSR17呈共分离. 该基因暂定名为wp(t).     

陆地棉红株基因(R1)的精细定位

利用陆地棉遗传背景的海岛棉染色体16置换系材料Sub16和陆地棉多基因标记系T586创建了含1259个单株的F₂作图群体, 结合本实验室最新的栽培四倍体棉种种间分子遗传图谱上染色体16的标记信息, 利用分子标记技术, 对红株基因R₁进行精细定位. 在F₂分离群体中, 红株性状分离比符合孟德尔1:2:1的分离, 进一步证明该性状是由一不完全显性单基因控制. 利用JoinMap 3.0连锁分析软件, 使用含237个单株的F₂小群体完成红株基因R₁的初级定位, 进一步利用含1259个单株的F₂大群体将该基因精细定位在NAU4956和NAU6752之间, 与最近标记的遗传距离为0.49 cM. 研究结果为进一步克隆该基因及培育红色彩棉转基因品种提供了研究基础.     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24 kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因. 利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合, 构建了含4892个单株的F₂定位群体. 同时, 利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库, 构建了一个覆盖目标基因位点的长约213 kb的跨叠克隆群. 根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列, 以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序, 设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位. xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离, 标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM, 物理距离约为24 kb. 对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测, 揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因. 对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

玉米抗纹枯病QTL分子标记定位

用抗玉米纹枯病自交系CML270和感病自交系478的(CML270×478)×CML270 BC_1∶2群体共322个株系为作图和定位群体, 构建了125个SSR标记位点的遗传连锁图谱, 覆盖玉米基因组1939.0 cM, 平均图距15.5 cM. 采用复合区间定位分析, 检测到玉米纹枯病抗病指数主效QTL位点3个, 2个位于第1染色体, 1个位于第7染色体上, 它们分别能解释表型变异的18%~20%; 控制株高的QTL位点7个, 分别位于第3~6染色体上, 控制“穗位高”的QTL位点5个, 分别位于第3, 4, 6染色体上. 自交系CML270玉米纹枯病抗性主效QTL真实存在, 抗性与植株高度遗传上不存在连锁关系, 为玉米纹枯病分子标记辅助选择(MAS)和抗性基因分离与克隆提供了技术和材料支撑.     

水稻散生突变体的遗传和基因定位研究

分蘖角度是构成水稻理想株型和高产育种的重要农艺性状之一. 通过对水稻散生突变体的遗传学分析认为, 该散生表型受一隐性核基因控制, 与已报道的水稻散生突变体la等位, 故将此突变体命名为la-2, 而原突变体被重新命名为la-1. 利用la-2与w11和浙福802分别杂交产生的F₂群体对LA位点进行遗传定位, 发现其与第11号染色体上的微卫星标记RM202和RM229连锁, 遗传距离分别为10.0和8.0 cM. 通过进一步在两标记间发展的6个新的分子标记, 将该基因精确地定位于约0.4 cM的区间. 为进一步克隆LA基因和探讨水稻分蘖角度的控制机制奠定了良好的基础.     

水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位

水稻稀穗突变体lax影响花序发育的主要特征是: 穗轴上能形成正常的一次、二次枝梗, 侧生小穗的发育被完全阻断, 只在枝梗的顶端发育形成单个小穗, 且小花呈多种异常变异. 突变体与粳稻品种W11杂交获得F₂分离群体. 以该F₂分离群体为基础, 根据水稻基因组序列设计微卫星引物和CAPS标记, 并进行连锁分析, 将稀穗基因定位在水稻第1染色体长臂的CAPS标记HB2和微卫星标记MRG4389之间, 与两标记间的距离均为0.14 cM, 与CAPS标记LZ1共分离. RT-PCR分析结果显示, 在稀穗突变体中与花器官发育相关的B功能基因OsMADS2, OsMADS4, OsMADS16 以及C功能基因OsMADS3的转录水平明显下降, 而A功能基因 RAP1A的转录水平未受到影响.     

水稻半矮秆基因sd-g的精细定位

矮秆基因的发掘、研究和利用是水稻株型改良育种和植物生长发育分子生物学研究的重要基础. 利用新桂矮双矮与02428杂交产生的F₂群体对sd-g进行了精细定位. sd-g基因首先被定位在水稻第5染色体上微卫星标记RM440和RM163之间, 遗传距离分别是0. 5和2.5 cM. 为了进一步精细定位sd-g基因, 利用已经公布的水稻基因组序列, 在sd-g基因附近区域寻找微卫星序列并发展新的标记, 在RM440和RM163之间发展了9个微卫星标记. sd-g基因被进一步定位在SSR5-1和SSR5-51之间, SSR5-1与sd-g之间距0. 1 cM, SSR5-51与sd-g之间相距0. 3 cM, 而SSR418与sd-g表现为共分离. 以此为基础, 构建覆盖sd-g基因区域的BAC重叠群, sd-g基因被定位在AC105319约85 kb的区段上, 这为sd-g基因的图位克隆奠定了基础.     

利用“永久F2”群体定位玉米株高的QTL与杂种优势位点

以我国大面积推广的优良玉米杂交种豫玉22的一套重组近交系为材料, 组配了含441个杂交组合的“永久F₂”群体, 构建了覆盖玉米10条染色体的遗传连锁图谱; 利用复合区间作图法, 在“永久F₂”和RIL群体中分别定位了12个和10个不同的株高QTL, 其中有6个在两个群体中同时检测到. 利用中亲优势值检测到10个玉米株高的杂种优势位点(heterotic loci, HL), 分布于玉米的7条染色体上, 多数HL表现以超显性效应为主, 单个HL可解释株高杂种优势表型变异的1.26%~8.41%. 只有少数QTL和HL具有相同的染色体位点, 说明玉米株高的表型性状和杂种优势可能由两种不同的遗传机理组成.     

水稻幼穗分化受阻突变体lhd的遗传分析与基因定位

从圭630/台湾粳的F₁花药培养后代群体中发现了水稻幼穗分化受阻突变体lhd(leafy head), 其植株明显矮化, 叶片细小且丛生, 始终停留在营养生长阶段. 遗传分析表明, lhd受一对隐性基因控制, 该突变基因拟命名为lhd (t). 显然, LHD(t)是控制花序分化的关键基因. 以lhd杂合体与明恢77和京花8号杂交, 建立了2个F₂群体. 在与京花8号杂交的F₂群体中, 部分lhd植株表现出“中间类型”, 说明遗传背景会影响突变性状的表现. 利用已公布的水稻RM系列SSR标记及自行设计的SSR标记, 结合BSA和突变株(共498株)分析, 将LHD(t)基因定位在第10染色体长臂端, 其中标记SSR1, RM269, RM258, RM304和RM171位于一侧, 与LHD(t)的图距分别为6.4, 16.6, 18.4, 22.2和26.3 cM; SSR4和SSR5位于另一侧, 与LHD(t)的图距分别为0.6和2.2 cM. 该结果为进一步对LHD(t)的克隆和表达研究奠定了基础.     

利用目标区段剩余杂合系进行大豆开花期QTL的验证和精细定位

以成熟期Ⅴ组的Essex为母本, Ⅱ组的ZDD2315为父本和轮回亲本, 创建114个单株的BC1F1群体; 采用250个SSR标记, 通过MAPMAKER3.0构建遗传图谱, 覆盖大豆基因组2963.5 cM. 采用WinQTLCart 2.5, IciMapping 2.0, MapQTL 5.0以及QTLnetwork 2.0共4种软件的6种遗传统计模型对BC1F3家系的开花期表型数据, 共检测到9个控制开花期的QTL. 6个能被至少两种模型检测到; 3个只被一种模型检测到, 其中Flwdt7定位在C2连锁群的Satt643和Sat_213之间, 置信距33.8 cM, 贡献率11.0%. 为验证此结果, 从BC1F5家系中选择该区间附近标记杂合单株, 经自交建立5个剩余杂合系(RHL), 分别在7个位点上有分离. 在检测遗传背景相对一致后将分离位点相同的合并, 采用JoinMap®3.0构建该区段子图谱. 用QTLnetwork 2.0 NWIM将Flwdt7定位在邻区间Satt277~Satt489, 离两侧标记的距离分别为1.40和0.45 cM, 置信距缩短为2.7 cM, 贡献率上升为36.8%. 再用RHL标记等位变异分组差异显著性分析和目标区间近等基因系分析等方法验证了该结果. 多种模型全基因组QTL初扫描基础上的目标区段剩余杂合系定位是一种有效的精细定位策略.     

光驱动FoF1-ATP合酶复合物顺时针旋转的观察

将含有10个组氨酸的嗜热菌F₁β亚基通过杂交引入光合细菌载色体(Chromatophores)复合物的F_oF₁-ATP合酶中. 对该杂交复合物的生化性质研究表明, 其具有较好的质子转运能力, 杂交的F_oF₁-ATP合酶能够有效地催化载色体的光合磷酸化, 其F₁β亚基的10个组氨酸可与Maleimido-C₃-NTA连接后再与FITC标记的肌动蛋白微丝连接. 光照后在荧光显微镜下观察到, 与该杂交复合物b亚基连接的荧光微丝顺时针方向旋转, 即质子动力势(pmf)引起的F_oF₁-ATP合酶F₁β亚基(或α₃β₃六聚体)上荧光微丝的顺时针方向旋转. 初步建立了F_oF₁-ATP合酶在pmf推动下F₁β亚基(或α₃β₃六聚体)旋转的研究体系.     

利用目标区段剩余杂合系进行大豆开花期QTL的验证和精细定位

以成熟期Ⅴ组的Essex为母本,Ⅱ组的ZDD2315为父本和轮回亲本,创建114个单株的BC1F1群体;采用250个SSR标记,通过MAPMAKER3.0构建遗传图谱,覆盖大豆基因组2963.5 cM.采用WinQTLCart 2.5,IciMapping 2.0,MapQTL 5.0以及QTLnetwork 2.0 共4种软件的6种遗传统计模型对BC1F3家系的开花期表型数据,共检测到9个控制开花期的QTL.6个能被至少两种模型检测到;3个只被一种模型检测到,其中Flwdt7定位在C2 连锁群的Satt643和Sat_213之间,置信距33.8 cM,贡献率11.0%.为验证此结果,从BC1F5 家系中选择该区间附近标记杂合单株,经自交建立5个剩余杂合系(RHL),分别在7个位点上有分离.在检测遗传背景相对一致后将分离位点相同的合并,采用JoinMap  3.0构建该区段子图谱.用QTLnetwork 2.0 NWIM将Flwdt7定位在邻区间Satt277~Satt489,离两侧标记的距离分别为1.40和0.45 cM,置信距缩短为2.7 cM,贡献率上升为36.8%.再用RHL 标记等位变异分组差异显著性分析和目标区间近等基因系分析等方法验证了该结果.多种模型全基因组QTL初扫描基础上的目标区段剩余杂合系定位是一种有效的精细定位策略.     

水稻穗部突变体Cl的形态和定位分析

簇生穗突变体Cl表型为多数枝梗顶端有2或3个小穗簇生在一起. 利用扫描电子显微镜观察显示, Cl的功能与水稻枝梗顶部的发育有关, 同时Cl影响了顶端小穗的伸长; 而Cl突变体中穗粒数有一定降低, 提示Cl基因可能对水稻穗粒数也有一定的影响. 分别利用Cl与中花11及Cl与浙辐802 杂交的F₂群体对Cl位点进行遗传定位, Cl位点初步定位在第6染色体的CAPS标记CK0214和SS0324之间. 为了进一步精细定位Cl位点, 在CK0214和SS0324之间发展了5个CAPS标记, 连锁分析表明, Cl与其中2个标记R0674E和C12560紧密连锁, 遗传距离分别为0.2和2.1 cM, 并且Cl被定位在这两个标记之间. 以此为起点, 构建覆盖Cl基因区域的PAC 重叠群, 两个PAC克隆AP004571和AP004236将Cl位点覆盖, 物理距离为196 kb, 为最终克隆Cl基因奠定了基础. 等位性测定显示, Cl与另一个水稻簇生穗突变体Cl2是等位突变.     

水稻早衰叶突变体基因psl1的遗传分析和精细定位

植物叶片是最主要的光合作用器官. 作物叶片生长、发育和衰老的分子机理研究与提高作物产量形成密切相关. 利用水稻中花11号经Co⁶⁰辐射产生的早衰叶突变体分别与南京6号和南京11号杂交的F₁及其衍生的F₂群体, 对早衰叶突变体进行了遗传分析和基因定位. 结果表明, 该早衰叶突变体是由一隐性核基因psl1控制, 利用SSR标记把psl1定位在水稻第2染色体上. 利用已经公布的水稻基因组序列, 在该基因附近区域发展了34对新的STS标记, 对psl1进行了精细定位. 以此为基础, 构建了覆盖psl1区域的BAC重叠群, 并把目标基因定位在一个约48 kb 的区段上, 为最终克隆目标基因奠定了基础.     

水稻F1花粉不育基因座S-b的精细定位

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍, 开展杂种不育基因的克隆和功能分析对于克服和缓解亚种间杂种的不育性具有重要的意义. 本研究在S-b座位初定位的基础上, 根据水稻基因组的序列发展微卫星标记, 将S-b座位定位在微卫星标记PSM8和PSM202之间. 为了精细定位S-b座位, 以S-b座位的近等基因系为材料培育了包含有3910株的F2作图群体, 同时根据PSM8和PSM202界定范围内的基因组序列发展了2个微卫星标记, 2个插入缺失多态性标记和4个CAPS标记. 利用作图群体中的重组株进行花粉育性表型与新发展标记基因型的连锁分析, 结果表明标记W4与S-b座位完全连锁, 而标记A8和A14位于S-b座位的两侧, 与S-b座位的遗传距离分别为0.026和0.038 cM. 将多态性标记与该区域克隆的序列进行整合, 结果表明, 新发展的多态性标记锚定在了AC093089, AC079021和AC134931三个首尾相连的克隆上. 根据各标记在物理图谱上的位置, 最终将S-b座位界定在了A8与A14之间27 kb的物理距离内. RiceGAAS注释表明该区域有7个预测ORF. 该结果为S-b座位进一步的功能分析奠定了基础.     

水稻Ac/Ds系统的Ds转座行为

将玉米的转座子系统Ac/Ds导入水稻基因组中诱导产生突变体的方法已成为构建水稻插入突变体库的主要策略之一. 本研究通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交, 构建水稻的Ac/Ds双因子转座系统, 对F₁~F₅代的Ds转座行为进行了研究. 通过转座检测, 发现1例Ds转座引起约170 bp T-DNA载体序列的缺失, 另1例Ds转座插入基因组时带有一段272 bp的T-DNA载体序列. 对F₁~F₅代Ds转座的连续检测结果表明, 配子体转座频率随世代的增加而提高, F3代的配子体转座频率达54.2%. 采用TAIL-PCR的方法扩增Ds元件旁侧的基因组序列, 对17个TAIL-PCR产物的序列进行了分析, 发现有5例Ds插入到基因序列中, Ds既可发生邻近位置的转座, 也可发生不连锁的转座, Ds在染色体间的转座频率为33.3%.     

陆地棉遗传标准系TM-1背景的海岛棉染色体片段置换系的培育

染色体片段置换系(chromosome segment substitution lines, CSSL)基因组内只含有一个来自供体亲本的染色体片段, 而基因组的其余部分与轮回亲本相同, 并能把QTL拆分为单个的孟德尔因子, 因此CSSL是进行基因组分析, 特别是QTL分析的理想材料. 本研究以陆地棉遗传标准系TM-1为受体亲本, 海岛棉海7124为供体亲本在BC₅S₁代借助分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)培育了一套染色体片段置换系. 这套置换系由330个株系构成; 1~4个不同的株系携带相同的染色体片段, 置换片段的平均长度为10.9 cM, 总长度为5271.9 cM, 是棉花基因组总长度3514.6 cM的1.5倍. 每个株系内被替换的染色体片段长度不一, 最短为3.5 cM, 最长为23.2 cM. 由于还有些区段缺失供体亲本的染色体片段, 所以这个替换系群体没有完全覆盖棉花基因组.