| Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用 |
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| 引用本文： | 饶华春,滕继云,刁勇,宋沁馨,王立强,杨会勇,周国华.Tm值差异型不对称PCR方法的建立及其在分子诊断中的应用[J].厦门大学学报(自然科学版),2016(4):485-494. |
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| 作者姓名： | 饶华春 滕继云 刁勇 宋沁馨 王立强 杨会勇 周国华 |
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| 作者单位： | 华侨大学生物医学学院分子药物研究院教育部分子药物研究中心;南京军区南京总医院药理科;中国药科大学药物分析教研室药物质量与安全预警教育部重点实验室 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金(31200979,81271691,82170734,30973591);国家国际科技合作项目(2011DFG33320);福建省自然科学基金(2016Y0063);江苏省基础研究计划(自然科学基金)项目(BK20151445);中国博士后科学基金(2012M512179,2013T6092);中国博士后科学基金特别资助(2013T60962);药物质量与安全预警教育部重点实验室项目(MKLDP2013MS01);江苏省青蓝工程项目;中央高校基本科研业务费专项(ZQN-PY319,2015ZD008);华侨大学高层次人才启动项目(09BS624) |
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| 摘 要： | 多数分子诊断方法对靶基因的检测都是以单链DNA为基础的,如何获得大量和高质量的单链靶DNA分子一直是研究热点.以包含BRCA1基因上3个单核苷酸多态性(SNP)的DNA片段为研究对象,通过调整不对称扩增引物碱基序列组成(5′-端引入错配或加入锁核苷酸(locked nucleic acid,LNA)),使用相差10倍浓度来增加不对称引物间Tm值差异,改进扩增条件(添加增强剂的扩增缓冲液,不同退火温度的二阶循环扩增程序)后,进行不对称扩增来产生大量单链靶DNA产物.结果表明Tm差异型不对称PCR(Tm difference asymmetric PCR,TDA-PCR)可有效提高单链DNA分子产率,降低引物设计难度,也扩大了模板序列的适用范围.此外,还针对禽流感病毒H5N1的血凝素(haemagglutinin)HA基因保守序列进行不对称扩增,用获得的单链DNA为模板进行焦磷酸测序检测,所得结果与参考序列一致且无明显干扰信号.因此,采用Tm值差异型不对称PCR可使焦磷酸测序等分子诊断流程更为简便,成本更低,效率更高,具有很好的通用性和实用性.
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| 关 键 词： | Tm值差异型不对称PCR 单链DNA模板 单核苷酸多态性 焦磷酸测序 禽流感病毒 |
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