| 荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复 |
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| 引用本文： | 顿宝庆,陆伟,张维,平淑珍,王旭静,陈明,徐玉泉,金丹,王劲,赵仲麟,梁爱敏,侯松娜,Ming-Qun Xu,林敏.荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复[J].科学通报,2006,51(12):1479-1481. |
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| 作者姓名： | 顿宝庆 陆伟 张维 平淑珍 王旭静 陈明 徐玉泉 金丹 王劲 赵仲麟 梁爱敏 侯松娜 Ming-Qun Xu 林敏 |
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| 作者单位： | 1. 中国农业科学院生物技术研究所,北京,100081
2. New Egland Biolabs,Inc.,Beverly,Massachusetts 01915,USA |
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| 基金项目： | 致谢 本工作为国家重点基础研究发展规划（批准号2001CB108904）和国家高技术研究发展计划（批准号2004AA214170）资助项目. |
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| 摘 要： | 利用GPS-LS接点扫描系统, 在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp (即编码5个氨基酸短肽)的外源片段, 建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库. 利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选, 测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点, 其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点. 从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二, N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE 内含子元件的原核表达双质粒上, 获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC. 将质粒pMEPSN295IN和pKEPSC296IC分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中, 携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长, 而携带单一质粒的不能生长, 表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建, 在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性, 酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg.
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| 关 键 词： | 基因拆分 内含肽(intein) 蛋白重建 转基因 |
| 收稿时间： | 2006-03-25 |
| 修稿时间： | 2006-03-252006-05-18 |
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