应用SNaPshot技术对桉树SNP的检测

【目的】SNaPshot是一种单核苷酸多态性(SNP)检测的多重分析技术,具有检测速度快、准确性高、成本低廉等特点。利用多重PCR技术,结合SNaPshot分型方法,在桉树中构建SNP复合分型检测体系,促进SNP技术在桉树遗传图谱构建和无性系鉴定的应用。【方法】利用桉树已有的EST序列设计引物,通过PCR产物直接测序进行SNP标记位点的开发,利用多重PCR技术和SNaPshot分型方法建立SNP复合分型检测体系,并在尾叶桉和细叶桉作图群体的两亲本和6个F₁子代,以及16个国内常用的桉树无性系中进行分型检测。【结果】共设计合成12对SNP引物,分为3组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)建立了SNP复合分型检测体系,SNP分型情况与测序结果一致。对桉树作图群体的两个亲本和6个F₁子代的分型结果进行统计,发现12个SNP标记在6个子代中均发生了分离; 对桉树无性系进行多态性的分析,期望杂合度(H_e)为0.11～0.51、观测杂合度(H_o)为0.11～0.56,多态性信息含量(PIC)为0.10～0.37,表现为中度或低度多态性。【结论】利用多重PCR和SNaPshot技术可以快速地对桉树进行基因分型,其结果准确可靠,可以用于桉树遗传图谱的构建以及桉树无性系的鉴定等方面研究。     

基于SSR标记构建宝巾花品种的分子指纹

【目的】针对宝巾花(Bougainvillea)品种繁多、同物异名和同名异物多有发生的现象,利用可靠的分子标记技术进行品种的有效分类。【方法】基于15个简单重复序列(SSR)位点,利用荧光标记的引物对131个宝巾花品种进行PCR扩增,扩增产物经毛细管电泳检测,分析品种多样性和遗传距离,并构建品种聚类图和指纹图谱。【结果】15个SSR位点共扩增出85个等位基因,平均每个位点的等位片段数5.60个,Shannon’s 信息指数、观测杂合度和期望杂合度的变化范围分别为0.38~1.53、0.11~0.94和0.16~0.73,平均值分别为1.04、0.50和0.57,位点的多态性信息量介于0.15~0.69之间,平均0.51。宝巾花品种的遗传距离为0.00~0.65,平均0.33;聚类分析表明,同一种的品种大多数聚在一类,但同一个种仍有品种未聚在一类或亚类,也有多个种的品种聚在一类;有多对品种存在同物异名或同名异物的现象;基于11个位点可有效鉴别131个品种,建立了各品种的分子指纹图谱。【结论】对同物异名或同名异物的品种,需要进一步确认品种中文名或拉丁名;基于SSR标记的宝巾花品种的指纹图谱为宝巾花品种登记、注册和知识产权保护提供了可靠技术,也为品种鉴定提供了有效手段。     

基于EST-SSR标记鉴定猴耳环自由授粉的全同胞子代

【目的】猴耳环是重要的药用树种,具有较好的工业应用价值。利用EST-SSR标记对猴耳环自然群体1株母树的自由授粉子代进行父本鉴定,从而确定全同胞子代,为基于全同胞家系的后续研究提供材料基础。【方法】以自然群体中母树ELS31自由授粉产生的1 489株子代及该群体内挂果的38株候选父本为材料,利用15个EST-SSR标记检测子代多样性和标记多态性,基于最大似然法鉴定各子代的父本,母本父本均相同的子代即构成全同胞家系,并估算群体内花粉传播距离,检验各父本对应的全同胞家系的多样性,通过卡方检验判断标记是否合乎预期的孟德尔分离比。【结果】15个EST-SSR标记的引物(对)共扩增出89个等位片段。子代群体期望杂合度(H_e)为0.525,表明群体多样性为中等水平;基于自然群体18株无亲缘关系的单株估算的标记平均多态性信息量(PIC)为0.736,表明标记多态性高。在1 489株自由授粉的子代中,确定了857株子代(57.6%)的34株父本。子代数最多的10个父本产生的子代数为26~184株,其他24个父本仅共产生子代139株。未发现自交子代,表明猴耳环是异交物种,自交的可能性极低。对子代数量20株以上的10个父本对应的全同胞家系观测杂合度(H_o)为0.502~0.693,H_e为0.417~0.544,各家系均是H_o大于H_e,表明存在一定程度的杂合子过剩。花粉传播的范围为10.0~559.1 m,平均119.2 m,但主要传播距离在150 m以内。716株子代(83.5%)的父本(10株)与母树距离在150 m以内。距离最远的父本ELS01 (559.1 m)和ELS02 (552.2 m)分别仅产生了9和12株子代。15个标记在子代20株以上的部分或全部全同胞家系中均有不同程度的偏分离,平均每家系的偏分离标记数为8.6个;偏分离最严重的是标记ARCeSSR141,在父本ELS30的全同胞家系中卡方(χ²)值为164.55。【结论】基于15个EST-SSR标记鉴定了猴耳环自然群体1株母本的1 489株自由授粉子代的父本,获得了子代20株以上的10个父本的全同胞家系。这为后续遗传测定、遗传图谱构建和数量性状位点定位等研究提供了材料基础。     

中大径材尾细桉杂种无性系选择研究

【目的】研究桉树无性系的遗传变异,选育适用于中大径材培育的桉树优良无性系,作为后续良种选育的基础。【方法】以12年生尾细桉(Eucalyptus urophylla × E. tereticornis)杂种无性系试验林的154个无性系为研究材料,结合12年间调查的生长性状和8年生时测定的材性性状,进行方差分析、相关性分析及遗传参数估算等,最后采用主成分分析法进行多性状综合选择。【结果】不同无性系间的生长和材性性状差异均达显著水平,即通过选择可提升培育尾细桉成优质大径材的潜力。中大径材尾细桉无性系开展早期选择的时间在4.5~6.5 a最适,生长性状对基本密度的间接选择效果均为正向,以树高最佳。各性状的无性系重复力为56.28%~85.34%,单株重复力为24.35%~59.27%,无性系重复力均大于单株重复力,各性状受较高的遗传调控,遗传稳定性高。定选的10个优良无性系的生长性状遗传增益为14.64%~73.89%。【结论】所选12年生尾细桉杂种无性系满足桉树中径材培育要求,具有培育成大径材的潜力。     

尾细桉生长和木材密度关联SNP挖掘与候选基因定位

【目的】生长和木材基本密度是桉树的重要经济性状,挖掘其候选功能基因可为桉树遗传改良提供参考。【方法】以尾叶桉(Eucalyptus urophylla)和细叶桉(Eucalyptus tereticornis) F1全同胞子代试验林为研究对象,测定其8年生树高、胸径和木材基本密度,开展表型遗传分析。筛选极端表型个体,利用测序分型(GBS)开发SNP标记进行关联分析。挖掘与树高、胸径和木材基本密度关联的SNP位点,并进行候选基因初步定位。【结果】尾细桉F1子代树高、胸径与木材基本密度间的表型变异系数为7.51%~26.19%,生长性状与木材基本密度显著正相关。利用GBS获得了覆盖全基因组的15 185个SNP位点,关联分析共鉴定111个与生长和木材基本密度显著关联的SNP,其中2号染色体上检测到强烈的生长性状关联信号。定位40个与生长和木材基本密度相关候选基因,共富集在52个GO terms,基因功能注释分析表明其功能主要与植物抗逆性、生物与非生物胁迫、转录因子家族等相关。【结论】本研究获得了一批与尾细桉生长和材性性状关联的SNP位点和候选基因,并进行了树高、胸径及木材基本密度候选基因初步定位,挖掘的与抗逆性相关的基因可能在树木的生长和木材形成中发挥重要作用。     

大花序桉群体适应性相关的SSR位点

【目的】检测大花序桉群体与环境适应性相关的基因组位点,为种质资源保护和利用提供分子生物学信息。【方法】利用84个SSR标记(包括29个基因组SSR 和55个EST-SSR)分析引种到广西,来源于澳大利亚昆土兰州北部和南部各7个大花序桉群体,通过Mantel 检验确定群体间是否存在地理隔离;检测群体间分化系数(F_st)离群值的受选择位点;并基于空间分析法检测与群体气候因子显著相关的等位片段,将显著相关位点的序列与NCBI数据库比对进行功能注释。【结果】大花序桉北部与南部群体间存在地理隔离,基于19个气候因子的聚类分析将北方与南方群体分为独立的组,这表明气候因子亦驱动了群体的分化。共检测到F_st离群值的受选择SSR位点39个(46.4%),其中,LOSITAN软件检测到12个正向选择位点和17个平衡选择位点。5个F_st离群值位点的6个等位片段与1个或多个气候因子显著相关(P<0.001),其等位频率在北部与南部群体间差异明显,其中,Embra6-118 bp与最冷月最低气温(T_mcm)显著相关,位点DNA序列的功能注释为碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)转录因子bHLH155;Embra20-121 bp与最暖季度降水量(P_wq)显著相关,位点的功能注释为蔗糖转运蛋白(sucrose transporters);EUCeSSR676-168 bp与T_mcm、P_wq、年均气温(T_ma)和最暖月最高气温(T_mwm)均显著相关,位点的功能注释为光系统Ⅱ稳定性/组装因子HCF136 (photosystem II stability/assembly factor HCF136);另外两个显著相关位点EUCeSSR298和EUCeSSR1009的功能未知。【结论】大花序桉北部与南部群体的显著分化受长期气候的影响,在第四纪大冰期可能存在北部和南部避难所。与气候因子显著相关的SSR位点在北部和南部群体间的等位频率差异为基于正向选择的气候适应性提供了分子证据。