根瘤菌87-1-1诱导刺槐根表皮传递细胞特异性表达的cDNA文库构建及序列分析

探寻根瘤菌诱导刺槐后根表皮细胞分化成传递细胞的特异性表达基因及其分子机制.采用抑制差减杂交(suppression subtraction hybridization,SSH)技术构建刺槐根系被接种根瘤菌和未被接种根瘤菌二者间的正反两个c DNA文库.各挑选正反文库中500个克隆进行测序,在Blastn、Blastp、Swiss Prot、KEGG、COG、Interpro以及Gene ontology(GO)数据库中进行比对注释.结合生理过程对ESTs进行分析,共获得725条非冗余序列(uni EST),正反向文库分别为385条和340条,其中包括674个单一序列(singlets),51个拼接序列(contigs).在Nt库比对中有674条uni ESTs与已知基因匹配,占比93%;在Nr库比对中有648条序列有匹配蛋白,占比89%.有正向文库213个uni ESTs和反向文库156个uni ESTs能进行Geney ontology(GO)功能注释,在细胞组分被注释了270次,分子功能被注释了448次,生物过程被注释了484次.uni ESTs的功能分析显示,正向文库中多与细胞翻译后修饰、转录因子、细胞信号通路、细胞壁/细胞膜/内膜系统以及细胞骨架相关蛋白有关,部分是结瘤相关基因.而反向文库中与细胞生长、代谢物形成的基因相关较多,这与根瘤菌处理刺槐后的生理过程一致.在根瘤菌诱导的刺槐根组织文库中发现特异性基因如MYB类转录因子、囊泡相关膜蛋白等与传递细胞相关的基因,结果有助于进一步研究此类传递细胞的形成分化机制.     

塑料半薄切片法观察豆科植物根表面传递细胞

豆科植物合欢、紫云英、苜蓿等在接种根瘤菌后，部分根毛密集生长稍有膨大的根段，经FAA固定，GMA包埋，半薄切片（3um),PAS反应染色，在光学显微镜油镜下观察根的横切面发现，其表皮细胞或外皮层细胞的外切向壁上有明显的壁内突结构，属典型的根表面传递细胞，采用半薄切片，不仅操作简单，费用较少，且较易确定传递细胞发生的部位。     

豆科树种根瘤菌共生体系的研究——Ⅰ.结瘤观察、分离、回接和交叉接种

对21个豆科树种,包括苏木亚科5个属、含羞草亚科6个属及蝶形花亚科5个属进行了结瘤观察。在田间苗圃及温室盆栽条件下,用未经灭菌的豆科树种根际土壤进行接种,其中只有12种结瘤;苏木亚科5个属的6种全不结瘤,南京常见豆科树种国槐也不结瘤。结瘤豆科树种的根瘤都经分离、纯化。根据对菌落培养性状及菌体形态特征的观察,可见全系典型的根瘤菌;对各原分离树种进行回接试验,进一步确定为各该树种根瘤菌。 9个不同树种根瘤菌经纯培养后,对一些树种进行了广泛的交叉接种试验。接种寄主除各豆科树种外,还包括绿豆、赤豆和豇豆。从所得结果看,大体上可将豆科树种根瘤菌归入豇豆族中。用分离所得的9个豆科树种根瘤菌纯培养的混合菌液在人为条件下接种,自然条件下未见结瘤的苏木亚科各树种和含羞草亚科的孔雀豆仍不结瘤。用2,4-D处理,则根部肿大畸形,甚至形成不规则形状的瘤体,但与真正的根瘤显然不同。观察的21个树种中有4种是首次报道,2种与过去报道的结瘤情况不同。     

诱导不结瘤豆科树种结瘤固氮的研究

根据国内外有关诱导非豆科作物结瘤固氮的现状,结合作者几年来的工作,对诱导不结瘤豆科树种结瘤固氮的可行性进行了探讨,并报道了作者近年来人工诱导不结瘤的豆科树种—山皂荚(Gledtsia melanacantha)的试验结果。     

八种豆科树种根瘤的形态与结构研究

对8种豆科树种根瘤的形态和结构进行观察，结果显示:根瘤形态多样，分有限根瘤和无限根瘤两类，根瘤形状、大小与根瘤类型之间有一定的相关性。豆科树种根瘤具有豆科植物根瘤的基本结构，即从外向内依次为皮层、维管束和含菌细胞区，但在皮层中发现有特殊的根瘤形成层细胞，可能与根瘤增粗及根瘤维管束的分化形成有关。豆科树种根瘤中维管束粗而发达，并具有木本植物根的中柱结构，包括有典型的环纹导管、筛管、纤维细胞等。     

豆科树种凝集素和根瘤菌胞外多糖结合反应与结瘤的关系

通过3种结瘤豆科树种合欢（Albizzia julibrissin）、马蹄针（Sophora davidii）、刺槐（Robinia pseudoacacia）和3种不结瘤豆科树种双决明（Cassia bicapsularis）、伞房决明（C．corymbosa）、黄槐决明（C．suffruticosa）的凝集素与13种根瘤菌胞外多糖的结合反应，在合欢、马蹄针和刺槐这3种树种中除合欢的凝集素不能与92-76菌株结合外，其余都能发生结合反应。而不结瘤的双决明、伞房决明和黄槐决明中也存在能与根瘤菌发生反应的凝集素，其中黄槐决明的凝集素可以与这13种根瘤菌株的胞外多糖都能发生凝集反应，但最终不能结瘤。因此豆科树种的凝集素与根瘤菌胞外多糖的结合可能仅是根瘤菌被吸附于豆科树种的根表，是它们之间建立共生体系的一个前提条件。     

根瘤菌入侵刺槐的途径研究

刺槐无菌苗接种根瘤菌后，在光学显微镜下观察根部形态发生了一系列变化，未接菌的刺槐苗根部根毛始终未发生形变；接菌的3～4d后形变明显根段经甘油透明及美兰染色，在光学显微镜下可清晰观察到根瘤菌入侵的部位和侵入线；根瘤菌的入侵点在根毛顶端弯曲或膨大处，侵入线由根毛的顶端向基部延伸，穿过表皮细胞壁进入皮层，在皮层细胞间分支延伸。     

刺槐根瘤发育过程外部形态和结构的观察

本文对豆科树种刺槐（Robinia pseudoacacia)根瘤发育过程的外部形态（形状、大小、颜色）变化进行了定位观察，并对各不同发育时期的根瘤内部结构变化 作了连续石蜡切片的观察，对它们之间关系进行了初步探讨。     

固氮细菌与杨树的联合固氮作用

从21个杨树无性系和家系根际分离筛选到具有较高固氮酶活性的5个菌株,分别接种到杨树无性系NL－80106组培苗根际,两个月后测定苗的生长量,结果表明接种固氮细菌的组培苗生长均好于对照。植株干重增幅可达17．9％－82．5％,苗高增幅达11．8％－29．6％,叶片的含氮量增幅为3．7％－21．5％,含磷量增幅为1．5％－57．0％,原位测定苗的固氮酶活性每株小时为12．25－45.81nmolC2H4,3号和71号菌株的接种效应最显,苗高,干重,地径,叶片数都达到了极显的水平,71号菌株处理苗的叶绿素含量,叶片中N,P含量最高,且其乙炔还原固氮酶活必也较高。说明这些菌株与杨树无性系NL－80106组培苗具有明显的联合固氮作用,同时也改善了磷的供应状况,促进了组培苗的生长。