CORRECT介导的人HBB-28基因定点突变细胞株的建立及其应用

为利用CRISPR/Cas9系统建立一种新型、高效的定点突变和基因修复的新方法——引入阻断突变碱基的CORRECT(Consecutive re-Guide or re-Cas steps to Erase CRISPR/Cas blocked Targets)方法，本研究使用规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)在线设计工具，针对人β-珠蛋白(HBB)基因设计小向导RNA (small guide RNA，sgRNA)，构建PX459-sgRNA-Cas9共表达质粒，然后以含阻断突变碱基(G>T)的单链寡核苷酸(single-stranded Oligo DNA Nucleotides,ssODNs)为同源模板，通过脂质体转染HEK293T细胞，并通过Sanger测序和酶切(T7EⅠ和AatⅡ)检测编辑效率，最后通过Sanger 测序分析敲除HBB单克隆细胞的基因型。结果表明，成功构建β-地中海贫血(简称β-地贫)HBB-28(A>G)基因纯合定点突变的HEK293T细胞株。阻断突变碱基优化的ssODNs减少Cas9蛋白对靶点的再次编辑，提高了整合效率。本研究建立的新型点突变技术可以高效获得纯合定点突变的HEK293T细胞株，既为单碱基突变疾病模型的建立提供实验依据，又为基因修复治疗提供高效的方法。