棒状杆菌亮氨酸操縱子在大肠杆菌中的克隆和表达

以质粒pTZ22为载体,用HindШ限制酶切割谷氨酸棒状杆菌染色体DNA进行克隆。分离到带有亮氨酸操纵子的4.5kb片段。用Southern切口移位分子杂交检测,证明在4.5kb的片段中既包含有leuB基因,而且对leuA基因也表现同源性。     

降钙素基因相关肽衍生物的制备及降血压功能研究

用PCR法将人的降钙素基因相关肽(calcitonin gene related—peptide,CGRP)基因克隆到表达载体pGEX-4T-2的GST基因后,构建成一个新的表达质粒pGEX—CGRP．另外分别将2个有降压功能的小肽HHL和RPLKPW的基因克隆到CGRP基因后,构建成2个表达质粒pGEX—CGRP-3AA和pGEX—CGRP-6AA．将此3个表达质粒转化到大肠杆菌TG1中,获得3个高表达的融合蛋白：GST—CGRP,GST—CGRP—HHL,GST—CGRP—RPLKPW;通过G1utathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白,测定蛋白浓度,利用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)来检测蛋白的降血压功能,发现融合蛋白GST—CGRP—HHL具有显著的降压效果,能使舒张压下降8．0kPa,且降压维持时间延长,达到70min以上．     

2个棒状杆菌质粒pXZ10142和pXZ10145.1及其转座子TN45的特征分析

对1株棒状杆菌1014中分离到的2个质粒pXZ10145．1和pXZ10142进行了相互关系分析．序列分析显示pXZ10142源自pXZ10145．1．pXZ10145．1包括6个开放读码框(open reading frame,ORF),其中ORF1编码247个氨基酸,经缺失分析是复制酶．在pXZ10145．1上发现1个转座子TN45,转座子上有CMR基因和TNP基因．一对颠倒重复序列IR1a和IR1b位于pXZ10145．1和pXZ10142的交互处,两边是顺向重复序列ATCTAG．     

O型口蹄疫病毒VP4蛋白一个保守性表位的精细鉴定

口蹄疫病毒(FMDV)的结构蛋白VP4在7个血清型之间是非常保守的,对其抗原表位最小基序的测定有助于开发广谱性多肽疫苗.本研究采用生物合成肽法,利用豚鼠抗FMDV O型标准血清,对最新流行的FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010的VP4蛋白进行了线性表位扫描作图研究.结果表明:在覆盖VP4蛋白全长序列的10个18聚肽中,发现1个能与豚鼠抗FMDV O型标准血清发生免疫印迹反应的抗原性肽VP4-3;B细胞表位鉴定确定了抗体识别VP4-3的最小基序是INNYYM;该表位位于VP4蛋白的三维结构表面;对7个FMDV血清型的122个毒株同源蛋白质进行序列比对,发现这一表位在7个FMDV血清型的120个毒株中是100%保守.     

含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点,而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果,近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体,分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141~160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141~160aa-21~40aa-141~160aa(BTB),构建对应重组杆状病毒,分别命名为reBAC-CAP-B,reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达,收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度,获得目的蛋白CAP-B,CAP-BTB,经过SDS-PAGE,Western blot鉴定正确,透射电镜观察到20~30nm大小的目的颗粒.     

以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗O型口蹄疫病毒重组活菌苗在家兔体内免疫应答的初步研究

将含有口蹄疫病毒疫苗基因的真核表达质粒pBO1经过中间宿主鼠伤寒沙门菌LB5010修饰后,电转化到减毒的猪霍乱沙门菌C500中,构建成抗O型口蹄疫病毒的重组活菌苗pBO1／S．cho．血清凝集实验验证,筛选到的转化菌仍然具有猪霍乱沙门菌的血清学特性,即具有免疫原性．采用口服方式免疫家兔,检测重组菌在家兔体内诱导的免疫应答．家兔免疫后8周,分离脾脏T细胞,检测T细胞增殖情况．结果显示,口服DBO1／S．fho的家兔T细胞在FMDV特异性抗原的刺激下有明显的增殖反应,刺激指数SI〉11;免疫后2周和8周分别取家兔静脉血,用液相阻断ELISA法检测血清中针对FMDV的特异性抗体,pBO1／S．cho组家兔产生的抗体效价为1／32。     

插入Tn21质粒的分离和链霉素抗性基因质粒的组建

在携带R100.1和pSO101质粒的Lc2640细胞中分离到重组质粒pXZ2712,该质粒对链霉素、氯化汞、磺胺和四环索有抗性。用仅带有Tn21两个末端的质粒pXZ2作为探针进行分子杂交,发现两者有同源性,说明质粒pXZ2712是由Tn21插入质粒pSC101所组成的。以pXZ2712质粒中分离到的带有链霉素抗性基因的片段,组建了带有抗链霉素基因的pXZ6(14.5kb)、pYP1(9.7kb)、pYP22(9.1kb)和pYP4(4.0kb)等质粒载体。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建Asia Ⅰ型口蹄疫病毒多肽疫苗,用反转录PCR方法扩增VPI基因并测得该基因的核苷酸序列．将VPI（133AA-163AA）、VP2（1AA～33AA）抗原表位基因分别与卢一半乳糖苷酶基因（简称LacZ＇）3’末端相连构建表达质粒LacZ’-VIP和LacZ’-VP2．化学合成VP1（133AA～163AA）-VP2（1AA～33AA）-VPl（133AA～163AA）串联重复抗原表位DNA,然后分别连接在β-半乳糖苷酶基因和IgG重链恒定区基因的3’末端,构建两种重组表达质粒LacZ’-VPl（133AA--163AA）-VP）2（1AA～33AA）-VP1（133AA-163AA）（命名为pTl）和IgGvPl（133AA～163AA）-VP2（1AA～33AA）-VPl（133AA-163AA）（命名为pT2）．通过Westernblot、血清中和抗体效价测定、T细胞增殖反应及豚鼠抗病毒保护实验分析所构建疫苗的免疫原性及有效性．结果显示pT1、pT2表达的融合蛋白能够诱发豚鼠产生较高的中和抗体及刺激豚鼠T细胞增殖．pT1、pT2两种融合蛋白分别2次免疫豚鼠后,100％的豚鼠能抵抗100 ID50 AsiaⅠ型口蹄疫病毒攻击．pT2融合蛋白1次免疫豚鼠后70％的豚鼠能抵抗100 ID50 AsiaⅠ型口蹄疫病毒攻击．     

合成的鼠心钠素基因的表达

心钠素作为一类激素,在临床上用于治疗某些心血管疾病,可能有重要意义。人和鼠的心钠素均由28个氨基酸组成,它们仅N端第12位的氨基酸不同,但二者的生物活性几乎相同。合成的鼠心钠素基因,在基因的N端和C端分别有一个EcoRI和BamHI酶切位点,在N端还设有一个甲硫氨酸密码子     

化学合成的α-降钙素基因相关肽基因在大肠杆菌中的融合表达及产物分离纯化

化学法合成的α－降钙素基因相关肽基因从pXZ101表达质粒转移到pUC18质粒中测序鉴定后,克隆到pGEX表达载体上,在大肠杆菌C600中表达．融合蛋白经谷胱甘肽亲和层析初步纯化,用凝血酶切去融合蛋白,经SephadexG－50柱纯化后,用溴化氰裂解,再经SephadexG－25柱纯化后得到纯品CGRP．经ELISA反应及放射免疫鉴定具有生物活性;经末端氨基酸测定与设计的一致．动物活体实验证明,大肠杆菌中表达的蛋白有降压活性．