红皮云杉体胚发生体系优化和超低温保存技术研究

【目的】通过对红皮云杉(Picea koraiensis)体细胞胚胎发生条件的筛选和超低温保存技术研究, 建立其完整的体胚发生体系及超低温保存条件,为红皮云杉优良种质资源的大量繁殖及保存提供基础。【方法】以红皮云杉合子胚为外植体,以两种基本培养基、6种植物生长调节剂组合为培养条件,筛选胚性愈伤组织诱导的适宜条件。并将获得的胚性愈伤组织进行超低温保存和体胚发育与成熟萌发试验,以3种脱落酸(ABA)和Gelrite浓度以及4种基本培养基为培养条件,筛选出体胚成熟和萌发的适宜培养条件。【结果】①两种基本培养基相比较,改良RJW(诱导率为30.00%)优于1/2 LV(诱导率为22.50%)基本培养基。当萘乙酸(NAA)质量浓度为3.0 mg/L、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)质量浓度为0.5 mg/L时胚性愈伤组织诱导率最高为50.00%;② 胚性愈伤组织增殖培养3个月后进行超低温保存试验,经恢复培养10 d 左右可以清晰地观察到成活的胚性愈伤组织,3个细胞系的胚性愈伤组织均可成活;③ 体胚发育阶段,改良RJW培养基添加Gelrite 6.0 g/L和ABA 20 mg/L时,3个细胞系体胚数量均较高,但是畸形胚比例也偏高,特别是HY-1细胞系畸形胚比例高达77.14%;当Gelrite质量浓度增加到8.0 g/L时,3个细胞系畸形胚比例均降低, 其中HY-2细胞系体胚数量为396.00个/g,畸形胚比例为10.33%;④ 红皮云杉体胚成熟培养两个月进行体胚萌发,在1/2 LM上体胚萌发能力最弱,其次是LM基本培养基,改良RJW体胚萌发能力最佳。不同细胞系体胚萌发能力也不同,体胚萌发能力最高为65.00%。【结论】① 胚性愈伤组织诱导的适宜培养基为改良RJW基本培养基,适宜的激素组合为NAA 3.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L;② 本试验进行超低温保存的细胞系均可成活;③ 体胚发育与成熟适宜的ABA质量浓度为20 mg/L,适宜Gelrite质量浓度为8.0 g/L;④ 体胚萌发的适宜基本培养基为改良RJW基本培养基。本研究建立了红皮云杉体胚发生体系并成功进行胚性愈伤组织的超低温保存条件,该技术体系可用于红皮云杉优良种质的快速繁殖。