利用绿色荧光蛋白研究大豆疫霉与大豆的互作

利用卵菌Bremia lactucae的hsp70启动子和ham34终止子序列, 将外源绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因转化进大豆疫霉. 利用荧光显微镜观察了gfp基因在大豆疫霉不同发育阶段的表达. 另外, 利用该报告基因系统观察了大豆疫霉在寄主大豆叶片、下胚轴和根部的侵染行为以及显微分析了不同抗性的大豆品种抗大豆疫病在根部的差异. 结果表明, gfp基因能够在大豆疫霉中稳定表达, 在菌丝、游动孢子囊、游动孢子、休止孢、卵孢子阶段都能够观察到绿色荧光; 以GFP作为标记可以实时地观察到大豆疫霉在寄主体内的侵染过程, 发现大豆疫霉在抗性大豆品种根部表面萌发的芽管明显长于在感病品种根部萌发的芽管长度. 结果表明, GFP可以作为大豆疫霉遗传研究中有价值的分子标记.     

疫霉菌激发子PB90诱导烟草悬浮细胞的凋亡

激发子PB90是疫霉菌(Phytophthora boehmeriae)分泌的一种分子量为90 kD的胞外蛋白激发子, 该激发子可以诱导非寄主植物烟草的过敏反应和系统获得抗性. BY-2烟草悬浮细胞经该激发子PB90处理后, Trypan blue染色观察到细胞死亡, 这种死亡可被蛋白质合成抑制剂Cycloheximide抑制, 表明这种细胞死亡是主动死亡过程. 提取PB90处理的悬浮细胞的DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察到DNA Ladder现象, 表明核小体间的DNA发生了断裂; 对经PB90分别处理4和12 h的烟草悬浮细胞进行TUNEL染色, 观察到较强的阳性信号, 进一步表明其细胞核内发生了DNA末端断裂; 同时结合DAPI染色观察到经PB90处理后的细胞染色质凝集、细胞核解体形成凋亡小体等细胞凋亡的形态学特征. 上述结果表明激发子PB90可以诱导BY-2烟草悬浮细胞发生细胞凋亡, 提示该激发子诱导的过敏反应是一个细胞凋亡过程.     

中国和美国大豆疫霉群体遗传结构的RAPD比较分析

为探究中国和美国大豆疫霉的遗传关系, 采用随机扩增DNA多态性(RAPD)的方法, 对来自中国黑龙江省、福建省和美国的3个大豆疫霉地理群体的遗传多样性进行了分析. 通过使用21个RAPD引物对供试的111株大豆疫霉菌株进行扩增, 共得到223个RAPD标记, 其中多态性标记为199个, 占89.23%. 遗传变异分析表明, 美国群体具有更高的遗传变异度; Nei’s遗传相似性和主成分分析均显示, 中国福建群体与美国群体间的遗传相似性最高, 而福建群体与黑龙江群体间遗传相似性最低; 聚类分析显示, 供试菌株在88%的相似性水平上可被区分为7个聚类, 且美国群体分布于更多的聚类组中; Shannon-Wiener多样性指数也表明美国群体的遗传多样性最为丰富. 综合分析表明, 本研究的结果不支持关于美国的大豆疫霉可能来源于中国的推测.     

大豆疫霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在病原物植物互作中诱导表达及其抗氧化作用在酵母遗传互补系统中的功能验证

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是真核生物细胞中一类功能丰富的蛋白质. 采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法, 筛选到一个在大豆疫霉侵染早期上调表达的、编码GAPDH的cDNA片段; 克隆了该基因的全长序列, 命名为PsGapdh. Southern杂交结果显示, PsGapdh在大豆疫霉基因组中含有3个拷贝. 该基因编码的氨基酸序列具有GAPDH的保守结构域. 在系统发育树中, PsGAPDH与两性绵霉(Achlya bisexualis)的GapC1同源性最高、与中华盒形藻(Odontella sinensis)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的GapC2同源性较高, 三者聚类分布于GapC亚族的C-Ⅱ分支. RT-PCR分析表明, 该基因在大豆疫霉侵染早期转录水平提高. 该基因可以恢复酵母突变体Δtdh1对H₂O₂的耐受性. 上述结果提示, 大豆疫霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有与酵母tdh1相似的抗氧化作用, 且参与了大豆疫霉对寄主植物的侵染过程.     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.