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1.
外源基因表达系统的研究进展   总被引:9,自引:0,他引:9  
最近20多年来,随着重组DNA技术的迅速发展,对于克隆基因表达问题的研究也日渐深入,并积累了相当丰富的知识。外源基因的表达系统包括原核表达系统和真核表达系统,它们各有优缺点,在选择时应衡量使用。  相似文献
2.
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是检测心肌损伤的理想标志物,具有很高的特异性,在病人体内可停留较长时间.以人心肌cDNA为模板,通过PCR方法克隆了人的cTnI和cTnC基因,将cTnI和cTnC基因插入到原核表达载体pBV220中,转化E.coli DH5α菌株并诱导表达,经SDS-PAGE分析,分别发现分子质量为28ku和18ku的特异性蛋白条带.cTnI经Western blotting检测,结果与天然蛋白一致.将纯化得到的cTnI免疫小鼠后,用人天然标准抗原检测小鼠的抗血清效价在1:16000以上,并且呈高度特异性,与cTnC无交叉反应.而表达的cTnC可以在一定条件下和cTnI结合,证明2种基因工程蛋白是具有天然构象和结合功能的.cTnI和cTnC的表达及2种蛋白结合试验的研究结果为进一步研发免疫诊断试剂奠定了良好的基础.  相似文献
3.
草鱼生长激素基因的克隆及原核表达研究   总被引:5,自引:2,他引:3  
应用RT-PCR技术从草鱼脑垂体总RNA中克隆草鱼生长激素cDNA(cGH),全长669bp,含开放阅读框633bp,编码210个氨基酸,分子量为23.6kDa,等电点为6.28;与已报道的草鱼GH有12个碱基、3个氨基酸残基的差异,同源性为98%.将草鱼cDNA定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组草鱼GH基因质粒pGEX-GcGH,经IPTG诱导,pGEX-GcGH在大肠杆菌中可表达49.6kDa的融合蛋白.  相似文献
4.
重组人粒细胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表达研究   总被引:4,自引:0,他引:4  
根据人天然粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因序列设计出引物,通过RT-PCR从人外周血单个核细胞mRNA获得G-CSFcDNA片段,将该片段与原核表达载体pT7构建成重组体,导入大肠杆菌后发现天然G-CSFcDNA表达量并不理想,这可能是由于天然hG-CSF5’端G+C的比例过高,使转录后的mRA很容易形成二级结构而影响翻译起始,因此在大肠杆菌中很难获得高效表达,根据密码子简并性原则,在不改变编码氨基酸顺序的前提下,通过重新设计PCR引物,将hG-CSF的前3个氨基酸密码子中的几个GC碱基作了改动,获得了新的cDNA突变体,将其与PT7的重组导入大肠杆菌,获得了高效表达。  相似文献
5.
汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究   总被引:3,自引:1,他引:2  
为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果,将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O.7kb的片段连接,克隆入pGEX一4T2,构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0.7,pGEX-4T2-S0.7G1,在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0.7或GST—S0.7G1融合蛋白。经IPTG诱导后,ELISA活性测定结果表明,两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合,融合蛋白GST—G1S0.7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示,诱导出G1S0.7或S0.7G1与GST的融合蛋白,其中G1S0.7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明:两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白,但表达效果不同,为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。  相似文献
6.
SARS冠状病毒N蛋白的表达及二级结构预测分析   总被引:3,自引:1,他引:2  
通过RT-PCR获得SARS冠状病毒N蛋白基因,分别克隆到原核表达载体pET21a,pET32a和pGEX-4T-1中,将3种重组质粒pET2la-N,pET32a-N和pGEX-4T-1-N分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,细菌中分别表达出约46kD的重组N蛋白、约60kD的6xHis-N融合蛋白和约70kD的GST-N融合蛋白,表达量分别达总蛋白的45%、40%和30%.进一步的分析表明:6xHis-N融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达,该可溶性组分占细菌裂解液的70%左右,且能被6xHis抗体所识别.用蛋白分析软件对N蛋白进行了序列分析和二级结构预测.SARS冠状病毒N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,有助于进一步结晶后进行X射线晶体衍射分析其结构与功能.  相似文献
7.
猪白细胞介素-6基因的原核表达及其活性研究   总被引:3,自引:0,他引:3  
用DNA重组技术,将已克隆的猪IL-6 cDNA片段插入pGEX-1λT质粒,转化大肠杆菌,以BamHI和Pst I酶切鉴定重组子,以IPTG诱导融合蛋白表达,并作RT-PCR及SDS-PAGE分析表达情况,从聚丙烯酰胺制备凝胶中回收融合蛋白,用MTT法测定重组蛋白刺激小鼠脾淋巴母细胞增殖反应的活性,并免疫家兔制备高免血清,得到高效表达猪IL-6的质粒pGPIL-6,RT-PCR确证pGPIL-6在大肠杆菌中能正确转录,经SDS-PAGE分析表达蛋白分子量为49kD,融合蛋白具有较高的促小鼠淋巴细胞增殖反应活性,以此免疫家兔,可制备滴度为1:128 000的兔高免血清。  相似文献
8.
西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达   总被引:3,自引:1,他引:2  
利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.  相似文献
9.
盐藻rbcS基因克隆及其原核表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,E,C.4,1.1.39简称RuBisCO)是光合作用中的关键酶,作者应用RT-PCR技术从一种极其耐盐的生物-杜氏盐藻的总RNA中克隆RuBisCO的小亚基(rbcS)的cDNA,它的开放读码框为570bp,编码190个氨基酸,将此cDNA定向克隆于原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒pET-rbcS,经IPTG诱导,在大肠杆菌株BL21中表达.SDS-PAGE电泳表明,rbcS融合蛋白分子量约为26kDa.  相似文献
10.
甘蓝型油菜植物防御素基因的克隆与原核表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
根据Genbank上已知的植物防御素基因设计引物,以甘蓝型油菜中的品种”蜀杂九号”种子总RNA反转录成的eDNA为模板,进行PCR扩增,获得了243bp的片段.将该片段回收。连接到pMD18-T载体测序,将测序片段经酶切回收后克隆到GTK表达载体中,在0.1mmol IPTG诱导下表达出与理论值相符的34kD的融合蛋白条带,用GST单克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,获得阳性结果,这为甘蓝型油菜植物防御素基因功能的进一步研究提供了基础.  相似文献
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