家蚕非编码RNA Bm-152功能初探

Bm-152是前期研究中发现的一个在家蚕丝腺中高表达的非编码RNA.采用实时荧光定量PCR技术对Bm-152在家蚕5龄到预蛹期不同发育天数丝腺中的表达谱进行检测.同时,在个体中过表达Bm-152,检测Bm-152可能参与的信号通路.结果显示,Bm-152在家蚕5龄幼虫丝腺发育过程中无明显的变化规律,但在吐丝第1天表达量较高,随后表达量又下降.通过在血淋巴中注射2μg piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]过表达载体,48h后发现Bm-152在丝腺组织中无明显过表达,但在非丝腺组织中可实现明显过表达,且表达量上调1.66倍;蜕皮激素信号通路基因Usp在非丝腺组织中上调1.95倍,E75A在非丝腺组织中上调2.26倍,保幼激素信号通路基因Met在非丝腺组织中上调1.79倍.表明非编码RNA Bm-152可能通过蜕皮激素和保幼激素信号通路参与家蚕发育,该结果为进一步探索Bm-152的功能提供了方向.     

靶向survivin基因的shRNA慢病毒载体的构建及其对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.     

番茄CDT2同源基因RNA干涉载体的构建及遗传转化研究

真核生物CDT2是CUL4-DDB1 E3泛素复合体的组成部分,在细胞周期调控、DNA复制与损伤修复中起到重要作用.本研究克隆了番茄CDT2同源基因片段并构建了CDT2基因RNA干涉植物表达载体pBI121-CDT2-RNAi.通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.半定量RT-PCR分析显示,转基因植株叶片内CDT2的表达量明显低于野生型植株.转基因植株叶片叶绿素含量比野生型明显升高.该研究结果揭示番茄CDT2基因的功能做出了新的尝试.     

PTTG基因对人垂体瘤细胞侵袭能力的影响

目的：本研究的目的在于PITG基因过表达及沉默对人垂体瘤细胞侵袭力的影响,探讨其与垂体瘤细胞侵袭性的关系及调控机制。方法：用脂质体转染携带PTTG基因的表达质粒,构建过表达PTTG基因的垂体细胞株,观察细胞形态。另外我们运用脂质体转染PITGsiRNA对垂体瘤中的PITG基因进行干扰;利用Western blot技术检测其基沉默效应;通过Transwell小室法测定垂体瘤细胞侵袭能力的改变。结果：转染PITG siRNA后,垂体瘤细胞中PTIG的mRNA转录和蛋白表达受抑,显著低于未经处理的垂体瘤细胞（P〈0.01）。利用PTTGsiRNA对PTTG进行RNA干扰后,垂体瘤细胞的侵袭能力下降。结论：（1）在正常垂体细胞中过表达PTTG基因也可以引起细胞癌变,增强侵袭能力。（2）设计的PTTG siRNA能有效抑制体外培养垂体瘤细胞中PTTG的mRNA转录和蛋白表达水平,实现其基因沉默效应。PTTG与人垂体瘤的侵袭能力密切相关,其表达水平下降导致细侵袭能力降低。     

高等真核生物中重叠基因研究

基因重叠是高等真核生物中一种普遍存在的基因组排现象．综述了高等真核生物中的重叠基因的分类、数量、互补或自然反义转录本（NATs）可能的生物特性和功能及重叠基因与人类疾病的关系．     

利用pGenesil-1.0构建人Dna2真核表达干扰载体

目的:构建人基因Dna2干扰(RNAi)的真核表达载体.方法:根据GenBank上人Dna2的cDNA序列设计并合成两条单链寡核苷酸,退火以后,插入质粒pGenesil-1.0多克隆位点的BamH I和Hind III之间进行重组,构建重组干扰载体,转化DH5α后测序鉴定出阳性菌株.重组质粒以脂质体法转染HeLa细胞,提取Dna2蛋白以免疫印迹法检验干扰效果.结果:设计的目的干扰序列5’-catagccagtagtattcgatg-3’可明显抑制Dna2在HeLa细胞的表达.结论:利用pGenesil-1.0构建的人Dna2干扰载体适用于该基因功能研究.     

特异性siRNA对大鼠肝星状细胞TIMP-1表达的影响

观察金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）小干扰RNA真核表达载体转染肝星状细胞株HSC-T6后TIMP-1基因表达的情况。构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的小干扰RNA真核表达载体pGCsi-U6／TIMP-1 shRNA，利用该载体介导四个特异性和一个非特异性的TIMP-1 shRNA，分别为TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA3、TIMP-1 shRNA4和TIMP-1 shRNA—NON。采用阳离子脂质体介导法转染HSC-T6细胞，激光共聚焦显微镜观察GFP表达，荧光实时定量PCR方法检测TIMP-1 mRNA表达情况。质粒转染HSC—T6细胞后，激光共聚焦显微镜观察转染组细胞内均见绿色荧光，未转染组未见绿色荧光；mRNA水平检测显示：与正常对照组相比，TIMP-1 shRNA1、TIMP—1 shRNA2和TIMP-1 shRNA4对TIMP-1基因表达较强的抑制作用，尤TIMP-1 shRNA1抑制作用最强（P〈0．01）。pGCsi—U6介导的TIMP-1 shRNA1能更加有效的抑制肝星状细胞中TIMP—1的表达。     

质心法:受类别驱动的RNA二级结构预测方法

RNA二级结构预测问题是计算分子生物学中的一个重要问题.目前的RNA二级结构预测模型和算法都是把待测结构RNA的一级序列作为输入,仅根据输入的序列预测其二级结构.这样做丢失了待测RNA的类别信息,进而无法利用同类别RNA二级结构的保守性.在实际的生物学研究中,对于关心二级结构的RNA,其类别往往是已知的.本文提出一种新的RNA二级结构预测思路:结合类别信息、根据已知的近似形状细化RNA的二级结构.这种方法尤其适用于长度较短、保守性好的非编码RNA.该方法的一个关键问题是如何将一个序列按照近似的形状进行折叠.为此本文首次提出了茎区的"质心"和"质心距"的概念,并且给出了一个结合了Hopfield网络和类别信息的RNA二级结构预测算法.实验表明本文提出的方法在所测试ncRNA分子上效果好于目前的方法.