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1.
通过对不同系统表达的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)纳米抗体与人Fc融合蛋白(11C12-Fc)的表达、纯化及抗体性质等的比较分析,比较不同表达系统的特点及其对融合抗体性质的影响;从而为CEA融合纳米抗体在体内检测方面的应用提供理论依据。构建两种11C12-Fc表达系统(Pichia pastoris和HEK293)相应的表达载体和菌株,分别进行诱导表达、分离纯化;并对其纯化产物的生物学活性等进行初步研究。成功构建了毕赤酵母、HEK293细胞两种CEA纳米抗体融合蛋白(11C12-Fc)表达系统并实现11C12-Fc的胞外分泌表达;通过protein A柱及阴离子交换层析纯化,获得了较高纯度和浓度的11C12-Fc样品;通过突变糖基化位点的方式有效去除了毕赤酵母表达11C12的过度糖基化作用;并且其抗体亲和力较突变前未发生明显改变,与HEK293细胞表达的11C12-Fc都表现出较高的亲和力。毕赤酵母和HEK293系统均能够表达具有较高生物活性的11C12-Fc,后续的科研或生产可根据实际需要和条件来合理选择表达系统。为后续的纳米抗体融合蛋白规模化生产、体内诊断与靶向治疗的应用提供了理论和技术参考。  相似文献   
2.
实验基于主要发酵副产物的生成含量评价优选发酵毕赤酵母与酿酒酵母混合发酵对葡萄酒质量的影响。采用优选发酵毕赤酵母Z9Y-3和商业酿酒酵母F33设计同时和顺序两种接种方式启动模拟葡萄汁的酒精发酵,以酿酒酵母和发酵毕赤酵母单菌株发酵为对照。琥珀酸和乳酸利用高效液相色谱法测定,甘油采用高碘酸钠氧化法分析,挥发酸采用水蒸气蒸馏法测定。结果显示,优选菌株参与下的发酵没有显著影响酒精发酵的进程,但在发酵过程中发酵毕赤酵母生长速率低于酿酒酵母。与酿酒酵母纯发酵相比,混合发酵提高了甘油的含量,降低了挥发酸的含量,其中顺序接种的发酵过程中酿酒酵母活菌数最高,发酵毕赤酵母存活期最长(7d),发酵过程中甘油累积量最高(2.7g/L),挥发酸含量最低(0.2g/L)。不同发酵处理中,琥珀酸和乳酸含量均呈现先增后降的趋势,但其最终含量变化不显著。综上可得,优选发酵毕赤酵母和酿酒酵母的混合发酵具有应用于葡萄酒酿造的应用潜力。  相似文献   
3.
为了实现菊粉内切酶在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高活性表达并对表达的菊粉内切酶酶学性质、水解菊粉的产物进行分析。通过下载无花果曲霉菊粉内切酶基因的编码序列,做了密码子优化后进行全基因合成,然后在毕赤酵母GS115中表达。对表达的菊粉内切酶的酶活、最适反应温度、最适pH值、热稳定性进行了分析,最后对酶水解菊粉的产物进行了高效液相色谱(HPLC)分析。摇瓶表达的酶活力为420 U/mL,酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为6.0。HPLC分析表明:表达的菊粉内切酶酶解底物菊粉的主要产物为低聚果糖,聚合度为3~5之间。构建的工程酵母可以高效表达菊粉内切酶,可以用于生产低聚果糖。  相似文献   
4.
【目的】提高朱黄青霉(Penicillium minioluteum )α-葡聚糖酶(Dextranase)基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达水平。【方法】根据毕赤酵母的密码子偏爱对酶基因进行优化与合成。优化后的基因片段与载体 pGAPZαA 连接,转化毕赤酵母 KM71 H。【结果】获得组成型分泌表达α-葡聚糖酶的工程菌 KM71 H/pGAPZαA-dex。发酵工艺试验中,摇瓶培养144 h,酶活为153 U/mL。6.8 L发酵罐补料分批培养92 h,酶活达到1218 U/mL。【结论】该工程菌以甘油作为碳源,发酵调控简单,产酶水平较高,具有适用于大规模生产的潜力。  相似文献   
5.
以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.  相似文献   
6.
Heterocapsa circularisquama RNA virus(HcRNAV) is the first single-stranded RNA virus to be characterized that infects dinoflagellates.The ability of HcRNAV coat protein(HcRNAV CP) to self-assemble into virus-like particles(VLPs) in vitro suggested that heterologous expression was possible,and that the VLPs might be ideal nanocontainers for the targeted delivery of genes and chemicals.In this paper,we report the expression of a codon-optimized HcRNAV 109 CP gene in Pichia pastoris and the production of self-assembled HcRNAV VLPs using large-scale fermentation.The HcRNAV 109 CP gene was synthesized according to the codon preference of P.pastoris and cloned into a pPICZA vector.The recombinant plasmid pPICZA-CPsyns was transformed into P.pastoris by electroporation.The resulting yeast colonies were screened by PCR and analyzed for protein expression by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.After large-scale fermentation,the yield of HcRNAV CPsyns reached approximately 2.5 g L 1 within 4 d.The HcRNAV VLPs were purified using PEG precipitation followed by cesium chloride density gradient ultracentrifugation,and were subsequently analyzed using UV spectrophotometry and transmission electron microscopy.Fluorescence dye-labeled myoglobin was loaded into the cages of the HcRNAV VLPs and the encapsulation was confirmed by fluorescence spectroscopy.The results point to the possible utilization in pharmacology or nanotechnology of HcRNAV VLPs produced by P.pastoris fermentation.  相似文献   
7.
人甲状旁腺素(Parathyroid hormone,PTH)是由人甲状旁腺主细胞分泌的直链肽,含84个氨基酸,是维持体内钙磷平衡的主要激素。PTH通过识别骨骼、小肠和肾脏等细胞表面特异性受体,与降钙素和维生素D共同调节Ca2+,PO43-的代谢,具有明显的成骨作用。研究发现,PTH的N-端34肽(PTH 1-34)具有完全的PTH受体结合能力与生物活性。目前PTH 1-34作为临床治疗骨质疏松症的注射剂已在美国上市,但价格昂贵且需要每天注射给药。而国内关于PTH1-34的临床研究很少,所以有必要通过基因工程手段获取PTH 1-34,降低成本并可大规模制备目的蛋白。本文概述了PTH近年来在国内外的研究情况,利用目前发展较快的毕赤酵母真核表达系统,构建了高效表达PTH 1-34毕赤酵母工程菌。为今后上发酵罐摸清条件。  相似文献   
8.
重组毕赤酵母G12-CBS经代谢工程改造,可高效表达重组S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶,并弱化了SAM转化途径的关键酶β-胱硫醚合成酶,是一株优良的SAM高产菌。为了利用G12-CBS高效合成SAM,需对前体(甲硫氨酸)的补料策略进行优化。首先在摇瓶中考察了不同甲硫氨酸(L-Methionine,L-Met)添加量对于G12-CBS的影响,发现每24hL-Met补加量超过3mg/mL时,会影响重组菌生长和SAM合成。在15L发酵罐中优化L-Met的补料速率,当外源补料速率为0.4g/(L·h)时SAM产量最高,分别比补料速率为0.2g/(L·h)和0.6g/(L·h)时提高22.2%和31.8%,达到13.01g/L,比出发菌最高产量提高54%。代谢物及酶活测定的结果表明,较低的L-Met补料速率(0.2g/(L·h))导致前体供应不足而影响SAM合成,过高的补料速率(0.6g/(L·h))可能会抑制三羧酸循环,并且影响氮源的摄取和利用,从而导致菌体生长和产物合成受到抑制。  相似文献   
9.
The gene hNGFB encoding the β subunit of human nerve growth factor (hNGF) was cloned intoP. pastoris secretive expression vector pHIL-S1 andE. coli expression vector pET-15b. The recombinant hNGFB vectors pSNGF and pET15b-NGF were transformed intoP. pastoris host cell GS115 (Mut+, His) andE. coli strain BL21 (DE3) respectively. Expression and secretion of hNGFB inP. pastoris was attempted under the direction of the AOX1 promoter and PHO1 signal sequence. The positive colonies growing on medium without histidine were further selected by PCR. The yield of rehNGFB in GS115 was about 14.4% of total cellular secretive protein. The secreted protein was immunological active on Western blotting with rabbit anti-mNGFB antibodies. The fusion protein yield of rehNGFB inE. coli BL21 (DE3) was about 10.3% of total cellular protein after IPTG induction. Western blot detection showed its immunological activity.  相似文献   
10.
通过酶学性质比较毕赤酵母GS115表达的E.coli K12植酸酶(appA)及其突变体植酸酶(appA NR)和黑曲霉植酸酶(phyA)的最适pH、温度、热稳定性及对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性.结果表明,在95℃,加热10 min,appA NR可残余90%左右的活力,而其他两种只残余20%~50%的活力;appAN...  相似文献   
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