Alkalibacterium sp. SL3中α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和性质研究

以大布苏盐碱湖分离菌Alkalibacterium sp. SL3的DNA为模板,利用PCR扩增α-半乳糖苷酶基因(galSL3),构建重组质粒pET-22b-galSL3,转化至大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达重组酶（rGalSL3）. 通过镍柱亲和层析分离纯化重组酶,并对纯化的重组酶进行性质研究. 研究表明,纯酶rGalSL3最适pH值为5.5,最适温度为55℃;该酶在pH值 5.0~10.0保持90%以上的剩余酶活,在50℃有非常好的热稳定性. 在0~1.5mol·L^-1 NaCl溶液中该酶的酶活基本不受影响,在3.0mol·L^-1 NaCl溶液中有很好的稳定性. Pb²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺、Triton-100和β-mercaptoethanol等对重组酶的活性有明显的促进作用. 该酶水解对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷的K_m、v_max和k_cat分别为(2.64±0.02)μmol·mL^-1、(454.55±0.59)μmol·(mg·min)^-1和(347.73±1.27)s^-1. 重组酶可水解蜜二糖和棉籽糖,不能水解瓜尔豆胶.     

水稻OsPPDK基因的克隆及生物信息学分析

利用比较基因组学方法,通过小麦TaNAM基因序列来设计引物,在早衰水稻品系金23B中寻找TaNAM的同源基因.对获得的c DNA片段进行序列比对分析,发现其与丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate phosphate dikinase,PPDK)基因高度同源,因此将其命名为OsPPDK(Oryza sativa PPDK).为进一步探索OsPPDK基因的功能及其与叶片衰老的关系,根据水稻预测OsPPDK基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆出OsPPDK基因的编码区,并进行生物信息学分析.结果表明:该基因全长为3 515 bp,包含一个完整的ORF,编码区长2 844 bp,编码947个氨基酸,分子量为102. 79 k D,所编码的氨基酸序列与其他已知的植物来源的PPDK基因相比,相似性大多在80%以上.在PPDK基因所编码的氨基酸序列中,发现了一个PEP利用酶位点信号,3个N-糖基化位点和15个酪蛋白激酶II磷酸化位点,12个蛋白激酶C磷酸化位点,2个酪氨酸激酶磷酸化位点和一个PEP利用酶位点.同时推测出多肽链中有规则重复的构象,并同源建模PPDK蛋白整条肽链的三维空间结构.     

粗毛栓菌漆酶基因的克隆、序列分析及荧光定量PCR分析

本研究通过提取不同培养条件下的粗毛栓菌总RNA,利用RT-PCR的方法克隆到1个新的漆酶基因,命名为Tglac3,编码区长1,560bp,预测编码519个氨基酸残基,其分子量为56.6kDa,理论等电点为5.77.用荧光定量RT-PCR法分析了该漆酶基因在不同培养条件下的表达水平,结果显示,高浓度的碳源和氮源均能诱导Tglac3基因的表达.     

西瓜八氢番茄红素合成酶基因全长的克隆与表达分析

通过RT-PCR和RACE技术从西瓜果实中克隆八氢番茄红素合成酶（PSY）基因的cDNA全长,用生物信息学方法对其cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,并用实时荧光定量PCR技术研究PSY在不同瓤色西瓜果实发育过程中的表达情况.结果表明,PSY基因cDNA全长1 561 bp（GenBank登录号为KC166870）,其开放阅读框为1 266 bp,编码421个氨基酸.该基因及其推导的氨基酸序列与同为葫芦科的其他植物的PSY及氨基酸序列的同源性分别为87％和91％以上;序列分析显示,PSY氨基酸序列N末端存在转运肽信号序列.不同瓤色西瓜果实发育过程中PSY的表达存在明显差异,红瓤果实中的表达量最高,这表明PSY可能与红瓤果实中积累较多的类胡萝卜素有关;PSY的表达量均高于PSY-A,推测PSY基因主要负责果实中类胡萝卜素的合成.     

痘病毒F10L基因的克隆及生物信息学分析

将古浪山羊痘病毒的基因组DNA提取出来,并设计引物进行PCR扩增,克隆F10L基因的DNA序列.为了分析山羊痘病毒F10蛋白的分子特征,将PCR产物连接到p GEM-T Easy载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对F10L基因序列进行预测分析.结果显示,F10L基因序列由1 335个核苷酸组成的开放阅读框,编码444个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值53.01 ku,理论等电点为7.14.该蛋白的二级结构中,α螺旋占12.44%,β折叠占15.73%,其余71.83%为无规则卷曲.多序列比对分析显示,不同羊痘病毒分离株F10L序列高度保守,一致性在97%以上.此研究结果为进一步研究F10蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础.     

黄斑蓝子鱼CRH基因的克隆及其在浅水应激后的mRNA表达

鱼类应激时主要启动两种生理反应系统,即"交感-嗜铬组织"系统/和/或"下丘脑-垂体-肾间组织轴"(HPI轴)系统.在实际生产操作中,鱼类容易受到浅水暴露应激.为了探讨黄斑蓝子鱼在受到浅水应激后HPI轴是否被激活,本研究克隆了下丘脑中启动HPI轴活性的关键因子—促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的基因,并检测其在应激前和受到浅水应激后不同时间点(0、20、40、60、80 min)的mRNA水平.结果显示,CRH前体的cDNA全长为1025 bp,编码170个氨基酸(aa),分别由一个信号肽(24个aa)、一个功能未知保守区(13个aa)和一个成熟肽(41个aa)组成;该CRH前体和成熟肽与其他鱼类的相应肽分别具有62%-98%和78%-100%的序列相似性.当鱼体受到短暂(4 min)浅水应激后80 min内,脑中CRH mRNA水平在应激前后无显著变化(P>0.05),说明黄斑蓝子鱼在受到急性浅水应激后可能主要启动"交感-嗜铬组织"系统而不是HPI轴.     

郑麦366γ-醇溶蛋白基因的克隆、系统进化和乳糜泻毒性分析

采用基因组PCR法,从强筋优质小麦品种郑麦366中克隆得到12个具有独特编码区的γ-醇溶蛋白新基因(命名为ZH366R-1-ZH366R-12,GenBank注册序列号为JN849083-JN849089和JX828391-JX828395),其中,ZH366R-5、ZH366R-8、ZH366R-11和ZH366R-12有完整的开放阅读框,除ZH366R-8存在一个额外的半胱氨酸(C)外,其他3个基因均具有γ-醇溶蛋白的典型分子特征,含有8个保守的半胱氨酸残基.克隆基因与42个来源于强筋优质小麦品种或代表普通小麦起源的二倍体祖先供体种的γ-醇溶蛋白的聚类分析和已知免疫多肽的分布分析表明,γ-醇溶蛋白在整个推断氨基酸序列和主要免疫肽的分布上均存在一定的基因组特异性.在重复区II含有1个额外半胱氨酸残基的γ-醇溶蛋白通常是由Gli-B1位点编码的,且在优质强筋小麦品种中均有分布,推测Gli-B1位点编码的γ-醇溶蛋白可能对面筋品质有独特贡献,而由Gli-D1位点编码的γ-醇溶蛋白,通常在重复区II分布有较多种类和数量的免疫多肽,乳糜泻(CD)毒性最强.     

茶树早期光诱导蛋白1基因的克隆和表达分析

报道了茶树早期光诱导蛋白1基因(CsELIP1)的cDNA和DNA序列的克隆.该基因编码蛋白含190个氨基酸残基,其基因组序列含有两个内含子(长度分别为129和855 bp).表达分析显示,CsELIP1的mR-NA水平在常温加较强光照(200μmol.m-2.s-1)和低温(5℃)弱光时上调都较少,但在5℃加200μmol.m-2.s-1时被强烈上调,表明CsELIP1的表达可能有一种在其他植物ELIP基因表达中存在的PSⅡ光合效率介导的调节方式.也暗示CsELIP1基因的生理作用可能涉及到茶叶细胞的光保护作用.     

拟南芥活性氧响应基因GDI功能初步分析

从拟南芥(Arabidopsis thaliana)T-DNA插入突变体库中筛选分离到活性氧敏感突变体gdi并克隆出相应基因GDI,生物信息学分析发现该基因具有多个ABA及氧化胁迫相关顺式作用元件,定量PCR及GUS染色结果表明该基因主要在花器官中表达,激光共聚焦实验显示GDI蛋白在细胞质中广泛分布.     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaC基因的克隆和序列分析及真核表达质粒的构建

参照GenBank上登录的副溶血弧菌鞭毛蛋白flaC基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaC全长基因,序列分析结果显示该基因为1 155 bp,编码384个氨基酸.与GenBank中其他弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaC基因与副溶血弧菌flaC基因的同源性最高(87%).将该基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,获得带溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因的真核表达重组质粒pcDNA-flaC,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.