用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠

以慢病毒（lentivirus）载体为骨架，携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的假病毒，通过小鼠受精卵卵周隙注射，将其感染小鼠受精卵，经移植于假孕母鼠后获得转基因小鼠．应用PCR、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等技术，证明了GFP基因的整合率达到40%以上；实时定量PCR分析结果表明转基因小鼠中GFP基因整合的拷贝数约为40；染色体荧光原位杂交分析结果显示GFP基因在小鼠染色体上的整合是随机的，并通过交配可将外源基因遗传至子代，获得的多整合位点和不同表达水平的转基因小鼠具有明显的实际应用和研究价值．文中报道的慢病毒载体介导的转基因技术为高效制备和选育高表达转基因小鼠品系提供了一种有效的途径．  

小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.  

慢病毒及其载体系统研究进展

基于慢病毒的病毒载体的研究已经发展到一定水平,因此用慢病毒作为基因转移媒介的临床研究已经开始,在实验室和临床应用中,慢病毒具有特别的优点,尤其是能整合未分裂细胞的独特能力.现在基于HIV的慢病毒载体的临床研究已经开始应用于人体.本文介绍基于HIV-1的慢病毒和慢病毒载体的结构,慢病毒载体的优点以及慢病毒载体应用的展望.  

含PGK启动子慢病毒表达质粒的构建与鉴定

为了构建一个含有人源PGK1(human phosphoglycerate kinase 1)启动子的慢病毒表达载体 pL-PGK-GFP.采用PCR从人组织中扩增PGK1基因的启动子部分,再用酶切-连接的方法将扩增的启动子区片段亚克隆入慢病毒表达质粒pL-EGFP中,再用测序、酶切和瞬时表达的方法进行鉴定.结果是下游的eGFP基因在PGK1启动子驱动下,在293FT细胞中表达绿色荧光蛋白报告基因,这表明成功构建了慢病毒表达质粒pL-PGK-GFP.扩增的537bp PGK1启动子片段具有一定的启动效率,能在HIV来源的慢病毒载体中驱动下游目的基因的表达.  

Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP慢病毒载体的构建与鉴定

构建含有myc-KyoT2融合基因片段的病毒载体,并在真核细胞中表达鉴定.方法:由科室保存质粒分别酶切得到Plenti/V5、IRES2-EGFP和myc-KyoT2基因片段,分别将myc-KyoT2基因片段插入质粒pIRES2-EGFP得到myc-KyoT2-IRES2-EGFP,然后将myc-KyoT2-IRES2-EGFP基因片段插入质粒Plenti/V5-GFP,构建病毒载体Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,应用免疫印记和荧光显微镜检测融合蛋白与绿色荧光蛋白的表达.获得了质粒myc-KyoT2-IRES2-EGFP和Plenti/V5-myc-KyoT2-IRES2-EGFP,myc-KyoT2融合蛋白和绿色荧光蛋白均正确表达.说明成功构建了含有myc-KyoT2-IRES2-EGFP融合基因的病毒载体,并在真核细胞中正确表达,为进一步研究急性T淋巴细胞白血病与Notch信号转导通路之间的关系奠定了基础.  

重组慢病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

慢病毒是一种具有独特优点和巨大应用潜力的哺乳动物细胞基因转移载体,我们对慢病毒载体对不同哺乳动物细胞的基因转移及表达效率进行了平行比较研究.应用第三代重组慢病毒系统构建了携带CMV启动子-EGFP报告基因表达元件的重组慢病毒Lenti-EGFP,分别对多种不同哺乳动物细胞进行转导实验,在转导48 h后应用流式细胞仪检测报告基因在不同细胞株中的转移及表达效率.我们共使用了29种哺乳动物细胞株,包括14种人类组织细胞,5种猴组织细胞,9种鼠组织细胞,1种兔组织细胞.结果显示,重组慢病毒具有良好的基因转移能力,可有效进入多数哺乳动物细胞,对不同种属来源的细胞没有表现出特别的偏嗜性,但对贴壁培养细胞的基因转移效率明显高于对悬浮培养细胞.本研究为重组慢病毒系统的合理使用提供了基础.  

慢病毒载体研究进展

慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展。本文就慢病毒载体及应用方面的研究进展作一综述。  

动物基因工程慢病毒载体--一种将传染性病毒颗粒转变成基因治疗的载体

慢病毒载体是一类逆转录载体,它既能感染分裂细胞,也能够感染非分裂细胞.也就是说,它能够广泛地应用于基因治疗,构建转基因动物和结合RNAi技术进行基因功能研究.  

不同重组慢病毒介导人凝血因子Ⅸ cDNA在血友病B小鼠中表达的影响

血友病B是凝血因子Ⅸ(hFⅨ)缺乏所导致的严重凝血功能障碍、X-连锁隐性遗传性疾病，在男性中的发病率为三万分之一．目前没有理想的治疗措施，而基因治疗可能是根治该病的安全、有效方法．该实验构建了ubiquitin—c和ABP(肝特异性)启动子指导hFⅨ表达的载体FUXW、FAXW，利用磷酸钙法共转染三质粒制备高滴度的重组慢病毒．将不同剂量的重组FUXW、FAXW病毒，分别用尾静脉液压法和静脉缓注法注射入血友病B小鼠体内，各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原，最高峰值为45ng／mL，表达持续超过60d．结果表明：hFⅨ蛋白的表达与病毒的剂量成正相关，重组FAXW病毒的hFⅨ表达量高于重组FUXW病毒，而尾静脉液压组和静脉缓注组在表达量、表达时间上没有显著差异．