用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠

以慢病毒（lentivirus）载体为骨架，携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的假病毒，通过小鼠受精卵卵周隙注射，将其感染小鼠受精卵，经移植于假孕母鼠后获得转基因小鼠．应用PCR、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等技术，证明了GFP基因的整合率达到40%以上；实时定量PCR分析结果表明转基因小鼠中GFP基因整合的拷贝数约为40；染色体荧光原位杂交分析结果显示GFP基因在小鼠染色体上的整合是随机的，并通过交配可将外源基因遗传至子代，获得的多整合位点和不同表达水平的转基因小鼠具有明显的实际应用和研究价值．文中报道的慢病毒载体介导的转基因技术为高效制备和选育高表达转基因小鼠品系提供了一种有效的途径．  

小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.  

慢病毒载体研究进展

慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展。本文就慢病毒载体及应用方面的研究进展作一综述。  

动物基因工程慢病毒载体--一种将传染性病毒颗粒转变成基因治疗的载体

慢病毒载体是一类逆转录载体,它既能感染分裂细胞,也能够感染非分裂细胞.也就是说,它能够广泛地应用于基因治疗,构建转基因动物和结合RNAi技术进行基因功能研究.  

不同重组慢病毒介导人凝血因子Ⅸ cDNA在血友病B小鼠中表达的影响

血友病B是凝血因子Ⅸ(hFⅨ)缺乏所导致的严重凝血功能障碍、X-连锁隐性遗传性疾病，在男性中的发病率为三万分之一．目前没有理想的治疗措施，而基因治疗可能是根治该病的安全、有效方法．该实验构建了ubiquitin—c和ABP(肝特异性)启动子指导hFⅨ表达的载体FUXW、FAXW，利用磷酸钙法共转染三质粒制备高滴度的重组慢病毒．将不同剂量的重组FUXW、FAXW病毒，分别用尾静脉液压法和静脉缓注法注射入血友病B小鼠体内，各治疗组小鼠血浆均可持续检测到hFⅨ抗原，最高峰值为45ng／mL，表达持续超过60d．结果表明：hFⅨ蛋白的表达与病毒的剂量成正相关，重组FAXW病毒的hFⅨ表达量高于重组FUXW病毒，而尾静脉液压组和静脉缓注组在表达量、表达时间上没有显著差异．  

动物基因工程慢病毒载体——一种将传染性病毒颗粒转变成基因治疗的载体

慢病毒载体是一类逆转录载体,它既能感染分裂细胞,也能够感染非分裂细胞.也就是说,它能够广泛地应用于基因治疗,构建转基因动物和结合RNAi技术进行基因功能研究.  

基于 Cre-LoxP 系统的新型慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P 的构建与鉴定

目的：基于 Cre-LoxP 系统构建携带 EGFP 及 Puromycin 抗性基因，并带有巨细胞病毒（CMV）及翻译延伸因子1α（EF1α）双启动子的新型慢病毒表达载体，为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统．方法：以已经插入 LoxP 序列的 pLOX-TERT-iresTK 慢病毒载体为模板，用 SpeI 与 KpnI 进行双酶切，去除 TERT-iresTK片段，然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接，构建 pLOX-MCS 表达载体．同时，以 pB513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro 表达框（带有 BamHI 及 KpnI 酶切位点），然后与经过 BamHI 及 KpnI 双酶切的 pLOX-MCS 载体连接，进而构建 pLOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro（简称 pLOX-CMV-E ／P）载体．将 pLOX-CMV-E ／P 载体与慢病毒包装载体pCMVR8．74及 pMD2．G 共转染293T 细胞，包装病毒进行报告基因的功能分析．结果：菌落聚合酶链式反应（PCR）、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致，绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能．结论：成功构建了pLOX-MCS 及 pLOX-CMV-E ／P 慢病毒表达载体，为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统．  

IFI27L2慢病毒稳定干涉细胞系的建立以及其在炎症小体激活中的功能鉴定

目的：通过构建IFI27L2分子的慢病毒干涉表达载体，建立IFI27L2表达下调的THP1、U937稳定细胞系。方法：将携带特异性干涉IFI27L2的DNA片段克隆插入pLKO.1载体中，并制备携带不同干涉序列的慢病毒颗粒。将获得的慢病毒颗粒感染THP1、U937细胞，建立稳定干涉细胞系，经Real-time PCR和Western blot法分别从mRNA 和蛋白质水平检测THP1、U937细胞中内源IFI27L2的干涉效果。结果：构建的重组质粒经酶切鉴定shRNA正确插入慢病毒载体，测序鉴定序列正确，并有干涉效果。结论：成功制备稳定干涉IFI27L2的慢病毒颗粒，建立IFI27L2稳定下调的THP1、U937两种细胞系，并初步证明稳定干涉IFI27L2能够抑制NLRP3炎症小体的激活。  

两种帕金森体外模型的构建及相关研究

为检测a－突触核蛋白（a－Synuclein）在人神经元母细胞瘤细胞（SH－SY5Y）中的表达，构建人野生型（WT）和A53T突变型a－Synuclein质粒（pEGFP－SNCA－WT和pEGFP－SNCA－A53T），经酶切鉴定无误后转染SH－SY5Y细胞，并对转染完成的细胞进行嘌呤霉素筛选，然后通过PCR法扩增转染后SH－SY5Y细胞的a－Synuclein片段，并对其进行测序，检测目的基因，运用Western blot法检测转染后SH－SY5Y细胞中a－Synuclein的表达．酶切鉴定结果表明pEGFP－SNCA－WT和pEGFP－SNCA－A53T质粒构建成功，嘌呤霉素筛选和转基因细胞a－Synuclein片段测序结果显示慢病毒表达载体能成功的整合到SH－SY5Y细胞基因组中，Western blot结果表明，转染后的SH－SY5Y细胞能成功的过表达a－Synuclein．a－Synuclein慢病毒表达载体构建成功，并且SH－SY5Y细胞作为宿主细胞能够表达a－Synuclein．为今后帕金森病（ PD）体外模型的建立及帕金森病发病机制的研究奠定了基础．