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1.
一种DNA侧翼序列分离技术--TAIL-PCR   总被引:15,自引:0,他引:15  
在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列,热不对称交错PCR(简称TAIL—PCR)反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环,利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段,所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL—PCR技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。笔综述了TAIL-PCR反应的原理、引物设计、反应条件设置及产物分析。  相似文献
2.
抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达   总被引:14,自引:0,他引:14  
采用PCR技术改造抗菌肽AD基因,将其C末端改造为Asn编码,改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZα-A载体上,构建成酵母重组分泌型表达载体,转化毕赤酵母(Pichia pastoris)受体菌GS115中,采用zerocin抗性标记筛选重组转化子,经摇瓶发酵,浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明,改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达,表达产物经α-Factor信号肽引导分泌到胞外,具有较强的杀菌活性。  相似文献
3.
胡萝卜抗冻蛋白基因的克隆及其在E.coli中的表达   总被引:14,自引:2,他引:12  
对中国的一个胡萝卜品种进行了冷诱导前后幼苗总蛋白组成的比较、分析 ,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明两者在相对分子质量 36 0 0 0附近有一条蛋白带的差别。由此推测实验的胡萝卜品种在冷诱导过程中有抗冻蛋白 (AFP)表达。根据相关的研究结果设计引物 ,以胡萝卜幼苗基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增得到了长 10 99bp的抗冻蛋白基因。测序结果表明其与GenBank公布的afp序列仅有 3个碱基的差别。将此抗冻蛋白基因克隆进大肠杆菌表达载体pGEX4T1,在IPTG的诱导下表达出了含有AFP的约 6 0 0 0 0的融合蛋白 ,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达  相似文献
4.
RACE的研究及其在植物基因克隆上的应用   总被引:12,自引:0,他引:12  
cDNA的末端快速扩增(RACE)是获得全长cDNA的有效手段之一。综述了RACE技术的原理,局限性、方法改进和新型RACE技术以及RACE在植物基因克隆上的相对优势,应用现状和未来的发展前景。  相似文献
5.
纳豆激酶原基因的克隆及表达   总被引:11,自引:0,他引:11  
从纳豆菌中克隆具有溶血栓性质的纳豆激酶原的基因,与质粒PBV220连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆用EcoR I/BamH I双酶切鉴定得到一条约1000bp的条带。阳性克隆经温度诱导表达,用SDS-PAGE电泳鉴定,在38kD处有一条明显的带,占菌体蛋白的20%左右,同时还表明该蛋白以包涵体的形式蛋白分子量为存在。包涵体经收集、蛋白变性及复性后显示溶血栓活性。  相似文献
6.
木霉菌的几丁质酶与植病生防   总被引:10,自引:1,他引:9  
木霉菌的几丁质酶是其防治植物真菌性病原菌的主要机制之一,它能降解真菌的细胞壁。木霉菌的几丁质酶具有结构和编码基因多样性。已经纯化的木霉菌几丁质酶有内切和外切几丁质酶,壳二糖酶和N—乙酰—β—D—葡萄糖胺酶。已经克隆的有编码33和42—KDa内切几丁质酶和编码73—KDa的N—乙酰—β—D—葡萄糖胺酶基因。42—KDa内切几丁质酶是目前研究最多的,已经用于转基因植物的培育;对它的表达和调控也有部分了解。  相似文献
7.
纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达   总被引:10,自引:3,他引:7  
构建pPICZαA-NK重组质粒,并转化入E.coli TOP-10中,得到转纳豆激酶基因工程菌,提取重组质粒经单酶切,双酶切,PCR分析及序列测定,证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因,将重组质粒pPICZαA-NK线性化后,分别转化毕赤酵母GS115与KM71,在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母,经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性,SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。  相似文献
8.
石斑鱼卵巢cDNA文库构建及脂肪酸结合蛋白克隆   总被引:9,自引:0,他引:9  
应用SMARPTM技术构建了斜带石斑鱼Epinephelus coioides卵巢cDNA文库。所构建的cDNA文库滴度为4.5×106 pfu/mL,重组率为99%,扩增后文库的滴度为1.2×1010pfu/mL。把phagemid转化为质粒后,随机挑选60个阳性克隆进行酶切鉴定和测序。酶切结果表明:插入片段长度均在500~3 000 bp之间。测序结果经过生物信息学分析,发现其中一个克隆为脂肪酸结合蛋白(FABP)基因全长,并与人肝型(L)脂肪酸结合蛋白同源性最高,为70%。  相似文献
9.
半夏凝集素基因的克隆   总被引:9,自引:1,他引:8  
利用RACE-PCR技术从半夏花序中克隆出半夏凝集素的全长cDNA,通过比较半夏同其他天南星科植物的凝集素基因序列和推测的氨基酸序列,发现半夏凝集素基因编码一具有信号肽的前体蛋白,半夏凝集素同其他天南星科植物凝集素一样,为具有3个甘露糖专一结合盒的凝集素。  相似文献
10.
普通野生稻中NBS同源序列的克隆和分析   总被引:9,自引:0,他引:9  
已知的植物抗病基因大多数具有核苷结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复(LRR)。根据NBS的保守区设计引物,应用聚合酶链式反应(PCR),从普通野生稻基因组中克隆了4个不同的NBS同源序列(OSNBA1-OSNBA4)。同源性比较显示它们均与非TIR类的NBS序列相似,其中,OSNBA1与双子叶植物拟南芥的RPS2基因更接近;OSNBA2-OSNBA4与单子叶植物水稻的XA1、RPR1基因更相似。  相似文献
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