外源基因表达系统的研究进展

最近20多年来，随着重组DNA技术的迅速发展，对于克隆基因表达问题的研究也日渐深入，并积累了相当丰富的知识。外源基因的表达系统包括原核表达系统和真核表达系统，它们各有优缺点，在选择时应衡量使用。  

结球甘蓝γ-生育酚甲基转移酶cDNA的克隆、分析及其异源表达酶蛋白的功能研究

采用3′-和5′-RACE技术,从结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)幼苗顶芽中克隆了γ-生育酚甲基转移酶的全长cDNA序列(BoTMT).该cDNA长1265bp,包含一个1044bp的开放阅读框,编码包括叶绿体导肽和两个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)在内的347个氨基酸组成的蛋白质.序列分析表明该蛋白质与目前已知的γ-生育酚甲基转移酶有41.8%～86.5%的同源性.半定量RT-PCR结果显示BoTMT主要在结球甘蓝的花和叶器官中表达.将BoTMT的成熟蛋白编码区序列克隆至原核表达载体pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达产物占菌体总蛋白的22%.体外酶活性测定结果表明表达的蛋白质具有γ-生育酚甲基转移酶活性,能有效地催化γ-生育酚甲基化生成α-生育酚.  

人心肌肌钙蛋白I和C亚基的基因工程表达及两者的结合实验

心肌肌钙蛋白I(cTnI)是检测心肌损伤的理想标志物，具有很高的特异性，在病人体内可停留较长时间．以人心肌cDNA为模板，通过PCR方法克隆了人的cTnI和cTnC基因，将cTnI和cTnC基因插入到原核表达载体pBV220中，转化E．coli DH5α菌株并诱导表达，经SDS-PAGE分析，分别发现分子质量为28ku和18ku的特异性蛋白条带．cTnI经Western blotting检测，结果与天然蛋白一致．将纯化得到的cTnI免疫小鼠后，用人天然标准抗原检测小鼠的抗血清效价在1：16000以上，并且呈高度特异性，与cTnC无交叉反应．而表达的cTnC可以在一定条件下和cTnI结合，证明2种基因工程蛋白是具有天然构象和结合功能的．cTnI和cTnC的表达及2种蛋白结合试验的研究结果为进一步研发免疫诊断试剂奠定了良好的基础．  

草鱼生长激素基因的克隆及原核表达研究

应用RT-PCR技术从草鱼脑垂体总RNA中克隆草鱼生长激素cDNA(cGH)，全长669bp，含开放阅读框633bp，编码210个氨基酸，分子量为23．6kDa，等电点为6．28；与已报道的草鱼GH有12个碱基、3个氨基酸残基的差异，同源性为98％．将草鱼cDNA定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，构建了重组草鱼GH基因质粒pGEX-GcGH，经IPTG诱导，pGEX-GcGH在大肠杆菌中可表达49．6kDa的融合蛋白．  

重组人粒细胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表达研究

根据人天然粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因序列设计出引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ从人外周血单个核细胞ｍＲＮＡ获得Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段，将该片段与原核表达载体ｐＴ７构建成重组体，导入大肠杆菌后发现天然Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达量并不理想，这可能是由于天然ｈＧ－ＣＳＦ５’端Ｇ＋Ｃ的比例过高，使转录后的ｍＲＡ很容易形成二级结构而影响翻译起始，因此在大肠杆菌中很难获得高效表达，根据密码子简并性原则，在不改变编码氨基酸顺序的前提下，通过重新设计ＰＣＲ引物，将ｈＧ－ＣＳＦ的前３个氨基酸密码子中的几个ＧＣ碱基作了改动，获得了新的ｃＤＮＡ突变体，将其与ＰＴ７的重组导入大肠杆菌，获得了高效表达。  

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。  

重组人B淋巴细胞刺激因子原核表达条件的优化

以重组人B淋巴细胞刺激因子(rhBLyS)蛋白表达宿主菌株M15(pQE30a／rhBLyS)作为研究对象，借助SDS-PAGE分析方法，对于用IPTG诱导的重组目的产物的表达进行了优化研究。分析比较了pH值、裂解液种类、诱导时问、IPTG浓度、温度等参数对重组产物表达的影响．实验结果表明，降低温度和IPTG浓度有利于增加靶蛋白的可溶性，27℃和0．075mol／L IPTG为比较适合的表达条件．  

水稻矮缩病毒基因组分析与部分基因片段的表达及功能研究

根据本实验室对水稻矮缩病毒中国福建分离株基因组全序列的测定。分析了其编码蛋白的功能，并将ＲＤＶＳ６，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ１１编码区ｃＤＮＡ分别克隆到表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＡ，ｐＢＶ２２１，ｐＴｒｃＨｉｓＢ和ｐＢＶ２２１中，构建成表在挝 ｐＴＨ－Ｓ６，ｐＢＶＰ９，ｐＴＨ－２１０，ｐＢ－ＶＰ１１。  

猪白细胞介素-6基因的原核表达及其活性研究

用DNA重组技术，将已克隆的猪IL－6 cDNA片段插入pGEX-1λT质粒，转化大肠杆菌，以BamHI和Pst I酶切鉴定重组子，以IPTG诱导融合蛋白表达，并作RT－PCR及SDS－PAGE分析表达情况，从聚丙烯酰胺制备凝胶中回收融合蛋白，用MTT法测定重组蛋白刺激小鼠脾淋巴母细胞增殖反应的活性，并免疫家兔制备高免血清，得到高效表达猪IL－6的质粒pGPIL-6,RT-PCR确证pGPIL-6在大肠杆菌中能正确转录，经SDS－PAGE分析表达蛋白分子量为49kD，融合蛋白具有较高的促小鼠淋巴细胞增殖反应活性，以此免疫家兔，可制备滴度为1：128 000的兔高免血清。  

西瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR方法获得了西瓜花叶病毒(WMV)陕西分离物外壳蛋白(CP)基因,大小为843 bp.将CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector,测序分析发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%~95.0%和96.5%~98.6%.将CP基因定向插入EcoR I/SalI切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导2~8 h后,成功表达了分子量约为37 kD的CP蛋白.通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4 h后蛋白开始表达,8 h后表达量比较大.以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6 400,Western blot分析能与CP发生血清学反应.