牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定

用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.  

天蚕抗菌肽B在毕赤酵母中的表达

Cecropins B是一种昆虫抗菌肽,具有分子量小,热稳定性、水溶性好、抗菌谱广等优点,更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用,仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,是目前已知天然抗菌肽中活力最强的一种。根据毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)偏好密码子,改造并化学合成天蚕素基因B,克隆到pPIC9K载体中,构建分泌型重组酵母表达载体CB-pPIC9K,转化Pichia pastoris受体菌KM71,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,Cecropin B获得表达,分子量约3.8KD,摇瓶发酵产率可达到200μg/mL,并对其抗菌活性进行了初步测定。结果表明我们表达的重组Cecropins B对G-菌有较好的抑菌活性,且具有较好的热稳定性。这些特点使得重组抗菌肽Cecropins B在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。  

抗菌肽A-蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克隆与初步分泌表达

采用 Ｅｃｏ Ｒ Ⅰ和 Ｂａｍ Ｈ Ⅰ接头将化学合成的大小为４５ 对碱基的 Ｃ Ａ（１ － ７） Ｍ（５ － １２） 杂合肽基因克隆到 Ｅ．ｃｏｌｉ 分泌表达载体ｐ Ｉ Ｎ－ Ⅲ· Ｏｍｐ Ａ２ 上的 Ｅｃｏ ＲⅠ－ Ｂａｍ ＨⅠ位点之间，并对其在 Ｌｐｐ启动子和 Ｌａｃ 启动子／ 操纵子调控下的分泌表达进行初步研究重组子的地高辛（ Ｄｉｇ） 核酸探针杂交和酶切分析结果表明杂合肽基因克隆成功；抑菌活性的检测结果表明杂合肽基因表达产物有一定的抑菌活性  

分泌性表达人rPA毕赤酵母工程菌株的构建及发酵条件的初步优化

通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断，将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPICgK／rPA，转化Pichia pastoris GS115宿主菌．通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His^ Mut^s表型转化子．并在2．0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10，GR11．摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明重组蛋白分子量约39ku，能与特异性单克隆抗体发生免疫反应；体外气泡法测定rPA活性，结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性．通过正交试验，优化发酵条件，表达活性最高为1050IU／mL．  

抗菌肽A—蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克？…

采用Ｅｃｏ ＲⅠ和ＢａｍＨ Ⅰ接头将化学合成的大小为５对碱基的ＣＡ（１－７）Ｍ（５－１２）杂合肽基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ分泌表达载体ｐＩＮ－Ⅲ．ＯｍｐＡ２上的ＥｃｏＲⅠＢａｍＨⅠ位点之间，并对其在Ｌｐｐ启动子和Ｌａｃ启动子／操纵调控下的分泌表达进行初步研究。  

曲霉属糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

从黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉中提取总RNA,RT-PCR分别获得其糖化酶基因,所得序列在Gen-Bank数据库中注册,注册号分别为AY652617、AY642120和DQ211971.BLAST分析显示,克隆的曲霉属糖化酶基因与GenBank数据库相应序列同源性很高.将这些糖化酶基因与表达载体pPIC9重组后,电转化进毕赤酵母株GS115,均获得了分泌表达糖化酶的酵母工程菌株.甲醇诱导72 h后,糖化酶的分泌量达到最高,分别为(11.6±0.2)、(12.4±0.2)和(10.0±0.2)U/mL.SDS-PAGE显示,分泌表达的糖化酶分子量均约为80 kDa.  

黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

鱼类抗菌肽hepcidin具有广谱抗菌活性.利用PCR技术扩增获得了黑鲷抗菌肽hepcidin (AS-hepc2)的前体肽和成熟肽 cDNA 序列,片段大小约250 bp.将其与毕赤酵母(Pichia pastoris) pPIC9K 质粒连接,构建了分泌表达载体pPIC9K/AS-hepc2 .电击法转化重组表达载体,经过G418筛选和选择性培养基以及PCR鉴定,得到的克隆子都为Mut+.以甲醇诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符.表达试验证明,随时间的延长,表达产物量增多,至120 h 达到高峰.表达产物具有很强的热稳定性.用抑菌圈法测定重组蛋白Pro-AS-hepc2 的抗菌活性,发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长.  

人血管生成素样蛋白4在毕赤氏酵母中的表达及其生物活性的初步研究

将编码人的血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)的cDNA克隆至分泌表达载体pPIC9k上，在Pichia Pastoris酵母宿主菌SMD1168中获得分泌表达；用MTT方法检测的细胞生长抑制实验结果表明，发酵液中分泌表达的重组蛋白ANGPTL4对人脐静脉内皮细胞的生长具有一定的抑制作用．  

α2b干扰素基因与Ag85B基因在毕赤氏酵母中的融合表达

Ag85是结核分枝杆菌的一种分枝菌酸转移酶复合体，在结核分枝杆菌的细胞壁合成过程中起着重要作用Ag85B是该复合体的一个组分，具有较好的免疫原性通过连接多肽（G4S）4的编码序列，将α2b干扰素基因与Ag85B基因连成融合基因，然后克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9上，转化Pichia pastoris SMD1168后获得重组酵母工程菌SMD1168／pPIC9-α2bAg85B，经甲醇诱导培养，发酵上清液经抗病毒活性测定，Western blot鉴定以及初步纯化，结果表明，分泌表达的融合蛋白具有一定的抗病毒活性．  

小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达

实验利用已构建的分泌型重组表达质粒pPIC9-mmLEAP-2，氯化锂转化表达宿主菌GS115毕赤酵母；应用表型和PCR技术筛选高拷贝转化株。经摇瓶发酵和甲醇诱导，SDS—PAGE分析重组mmLEAP-2表达量，为进一步研究mmLEAP-2的活性奠定了基础。