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1.
牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定   总被引:7,自引:1,他引:6  
用RT_PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn_Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly_Asp_Asp_Asp_Asp_Lys_β_naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx_hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp_Asp_Asp_Asp_Lys_肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.  相似文献
2.
天蚕抗菌肽B在毕赤酵母中的表达   总被引:6,自引:0,他引:6  
Cecropins B是一种昆虫抗菌肽,具有分子量小,热稳定性、水溶性好、抗菌谱广等优点,更为重要的是抗菌肽对真核细胞几乎没有作用,仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,是目前已知天然抗菌肽中活力最强的一种。根据毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)偏好密码子,改造并化学合成天蚕素基因B,克隆到pPIC9K载体中,构建分泌型重组酵母表达载体CB-pPIC9K,转化Pichia pastoris受体菌KM71,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,Cecropin B获得表达,分子量约3.8KD,摇瓶发酵产率可达到200μg/mL,并对其抗菌活性进行了初步测定。结果表明我们表达的重组Cecropins B对G-菌有较好的抑菌活性,且具有较好的热稳定性。这些特点使得重组抗菌肽Cecropins B在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。  相似文献
3.
采用 Eco R Ⅰ和 Bam H Ⅰ接头将化学合成的大小为45 对碱基的 C A(1 - 7) M(5 - 12) 杂合肽基因克隆到 E.coli 分泌表达载体p I N- Ⅲ· Omp A2 上的 Eco RⅠ- Bam HⅠ位点之间,并对其在 Lpp启动子和 Lac 启动子/ 操纵子调控下的分泌表达进行初步研究重组子的地高辛( Dig) 核酸探针杂交和酶切分析结果表明杂合肽基因克隆成功;抑菌活性的检测结果表明杂合肽基因表达产物有一定的抑菌活性  相似文献
4.
通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断,将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中,构建了重组表达质粒pPICgK/rPA,转化Pichia pastoris GS115宿主菌.通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况,筛选His^ Mut^s表型转化子.并在2.0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10,GR11.摇瓶培养,甲醇诱导外源基因表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明重组蛋白分子量约39ku,能与特异性单克隆抗体发生免疫反应;体外气泡法测定rPA活性,结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性.通过正交试验,优化发酵条件,表达活性最高为1050IU/mL.  相似文献
5.
抗菌肽A—蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克?…   总被引:2,自引:0,他引:2  
采用Eco RⅠ和BamH Ⅰ接头将化学合成的大小为5对碱基的CA(1-7)M(5-12)杂合肽基因克隆到E.coli分泌表达载体pIN-Ⅲ.OmpA2上的EcoRⅠBamHⅠ位点之间,并对其在Lpp启动子和Lac启动子/操纵调控下的分泌表达进行初步研究。  相似文献
6.
黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性   总被引:2,自引:0,他引:2  
鱼类抗菌肽hepcidin具有广谱抗菌活性.利用PCR技术扩增获得了黑鲷抗菌肽hepcidin (AS-hepc2)的前体肽和成熟肽 cDNA 序列,片段大小约250 bp.将其与毕赤酵母(Pichia pastoris) pPIC9K 质粒连接,构建了分泌表达载体pPIC9K/AS-hepc2 .电击法转化重组表达载体,经过G418筛选和选择性培养基以及PCR鉴定,得到的克隆子都为Mut+.以甲醇诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符.表达试验证明,随时间的延长,表达产物量增多,至120 h 达到高峰.表达产物具有很强的热稳定性.用抑菌圈法测定重组蛋白Pro-AS-hepc2 的抗菌活性,发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长.  相似文献
7.
曲霉属糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
从黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉中提取总RNA,RT-PCR分别获得其糖化酶基因,所得序列在Gen-Bank数据库中注册,注册号分别为AY652617、AY642120和DQ211971.BLAST分析显示,克隆的曲霉属糖化酶基因与GenBank数据库相应序列同源性很高.将这些糖化酶基因与表达载体pPIC9重组后,电转化进毕赤酵母株GS115,均获得了分泌表达糖化酶的酵母工程菌株.甲醇诱导72 h后,糖化酶的分泌量达到最高,分别为(11.6±0.2)、(12.4±0.2)和(10.0±0.2)U/mL.SDS-PAGE显示,分泌表达的糖化酶分子量均约为80 kDa.  相似文献
8.
将编码人的血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)的cDNA克隆至分泌表达载体pPIC9k上,在Pichia Pastoris酵母宿主菌SMD1168中获得分泌表达;用MTT方法检测的细胞生长抑制实验结果表明,发酵液中分泌表达的重组蛋白ANGPTL4对人脐静脉内皮细胞的生长具有一定的抑制作用.  相似文献
9.
不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响   总被引:1,自引:0,他引:1  
通过多拷贝串联表达,以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽,以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平.实验结果表明:2~5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平,而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内.在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌,与不含间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比,含有糖基化位点(NTTEEGEPK)和肠激酶识别位点(DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍.  相似文献
10.
α2b干扰素基因与Ag85B基因在毕赤氏酵母中的融合表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
Ag85是结核分枝杆菌的一种分枝菌酸转移酶复合体,在结核分枝杆菌的细胞壁合成过程中起着重要作用Ag85B是该复合体的一个组分,具有较好的免疫原性通过连接多肽(G4S)4的编码序列,将α2b干扰素基因与Ag85B基因连成融合基因,然后克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9上,转化Pichia pastoris SMD1168后获得重组酵母工程菌SMD1168/pPIC9-α2bAg85B,经甲醇诱导培养,发酵上清液经抗病毒活性测定,Western blot鉴定以及初步纯化,结果表明,分泌表达的融合蛋白具有一定的抗病毒活性.  相似文献
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