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为避免诱导基因稳定表达的Tet-On诱导表达系统溢漏表达,实现简便且高效的外源基因稳定诱导表达, 本研究拟在Tet-On调控的转录水平基础上,将基于稳定配体Shield-1的不稳定结构域FK506结合蛋白引入目的基因的N端,从蛋白水平控制其本底表达水平.为验证该系统的效果,本研究以荧光蛋白TdTomato为报告基因,经流式分析结果证明优化后的体系较原体系的溢漏表达在蛋白水平上降低7倍左右.将该系统应用于基于小鼠胚胎干细胞的体外牙向分化模型,在诱导因子Dox和稳定配体Shield-1的协同作用下,诱导表达牙齿发育相关转录因子Hand2提高了牙向分化诱导的完成度. 相似文献
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为开发高效率的内源多基因激活工具,利用CRISPR/Cpf1系统能够促使pre-crRNA中多个crRNA自我剪切和释放的特性,将As/Fn/LbCpf1的核酸酶区域定点突变形成dCpf1,并在C端和N端分别引入了VPR三元转录激活域和不稳定结构域(DD-domain)、四环素控制的操纵子,构建了TRE3G-DD-dCpf1-VPR激活系统。结果显示,Oct4基因的转录水平提升高达10~4倍,且Myod1、Oct4基因的转录水平分别在Dox和TMP单药的控制下,能够实现不同程度的转录水平的提升,在加双药的条件下Myod1、Oct4基因可分别提高80、120多倍。证明该系统能够通过靶向DNA快捷、高效的进行诱导内源性多基因激活。 相似文献
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为减少在CRISPR/Cas9基因编缉系统中,sgRNA通常由Ⅲ型启动子持续转录产生,Ⅲ型启动子不易控制,sgRNA持续表达又容易产生细胞毒性这一缺陷,本文拟建立由Ⅱ型启动子转录,并由内含子中释放sgRNA的方法.我们在sgRNA的两端设计了三种"核酶-sgRNA-核酶"的组合,通过核酶的自剪切作用实现sgRNA的释放.实验结果表明,HHRz-sgRNA-HDVRz的设计能够正确的从内含子中释放sgRNA,并且该sgRNA在构建的copGFP敲除模型中能够实现有效的基因编辑.这一发现证明在哺乳动物细胞中利用Ⅱ型启动子,在核酶和内含子剪切的协助下可以实现sgRNA的表达,这为Cas9和sgRNA整合在一个Ⅱ型启动子之下实现组织特异性和药物诱导性表达提供了基础. 相似文献
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