钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)多克隆抗体的制备

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2(SNAT2)属于SLC38家族,参与小的中性氨基酸跨膜转运,在哺乳动物组织中广泛表达.SNAT2的功能紊乱可以导致许多神经性疾病,如阿尔茨海默症、帕金森症等.采用PCR方法扩增得到SNAT2氨基端75个氨基酸的编码序列,构建重组质粒pET28a-SNAT2-75aa,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达重组蛋白.利用组氨酸标签蛋白经镍柱亲和纯化后得到了纯度在95%以上的SNAT2氨基端蛋白SNAT2-75aa,将其作为免疫原免疫新西兰大白兔,从而获得SNAT2多克隆抗体.采用巯丙基琼脂糖凝胶6B(Thiopropyl sepharose)固定抗原亲和纯化法进一步对该抗体进行纯化,纯化后的抗体效价至少提高10倍.蛋白免疫印迹确定该抗体对SNAT2具有高度的特异性,表明SNAT2多克隆抗体制备的成功,为进一步研究SNAT2蛋白的结构和功能奠定了生化基础.     

N-糖酰胺酶F(PNGase F)在大肠杆菌中的表达纯化及其脱糖基化作用鉴定

N-糖酰胺酶F(PNGase F)是由革兰氏阴性菌——脑膜炎脓杆菌分泌的一种分子量为34.8 kDa的去糖基化酶.本研究通过PCR技术扩增出945 bp的N-糖酰胺酶F基因,经酶切、连接,构建了大肠杆菌表达载体pET28a-PNGase F.将pET28a-PNGase F转入大肠杆菌BL21中,16℃诱导表达及Ni柱纯化后,SDS-PAGE鉴定,获得超过95%纯度的可溶性表达的N-糖酰胺酶F.对Na+依赖的中性氨基酸转运蛋白1(SNAT1)和2(SNAT2)进行脱糖基化作用检测,结果证明:纯化的N-糖酰胺酶F对SNAT1和SNAT2具有高效的脱糖基化作用.     

大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定

SLC38基因家族编码的Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白3(SNAT3)是System N中的一员.它在大脑谷氨酸-谷氨酰胺循环以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程中发挥着重要作用.为了方便检测SNAT3在细胞膜上的表达与定位,本研究采用PCR扩增和酶切连接技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SNAT3的N末端连接,通过菌液PCR、酶切和DNA测序验证得到pBK-CMV(Δ[1098-1300])-EGFP-SNAT3重组真核表达质粒.用脂质体转染法将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞(HEK293T cells),利用激光扫描共聚焦显微镜和Western blot技术检测EGFP-SNAT3融合蛋白的表达和亚细胞定位.结果表明,EGFPSNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上.EGFP-SNAT3重组质粒的成功构建将有助于日后进一步研究SNAT3的结构和功能.