CUEDC2突变体的构建及在原核和昆虫表达系统中的表达

目的：构建CUEDC2的突变体并在原核和昆虫表达系统中表达验证。方法：根据人cuedc2序列设计引物,以其突变体质粒为模板PCR扩增目的片段,酶切后连接至pET28a原核表达载体以及pFastBac1-Flag-N和pFastBac-HTA昆虫表达系统的表达载体,转化至DH5α后提取质粒,经菌液PCR、测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3)及DH10Bac感受态细胞中。原核表达载体在E.coli中表达后用Ni-NTA亲和纯化,SDS-PAGE检测。昆虫表达载体提取杆粒,转染至昆虫细胞Sf9中表达,最后用western 进行鉴定。结果：成功构建了CUEDC2的突变体,并在原核和昆虫表达系统中表达。结论：在原核和昆虫表达系统中,成功表达的CUEDC2突变体蛋白为CUEDC2的结构和功能研究奠定了基础。     

体外APC/C活性体系的建立及其影响因素的研究

为获得具有细胞周期后期促进复合物(APC/C)活性的细胞裂解液并建立APC/C体外活性检测体系,以其底物Cyc-lin B及Securin的降解为检测指标,分别从细胞阻滞于有丝分裂期的时间,UBCH10(APC/C的E2酶)的浓度以及裂解液浓度等几个方面研究了各种处理因素对APC/C活性的影响,并且用体外翻译底物验证了其活性及相关结论。此项工作为进一步探索APC/C相关分子事件奠定了基础。     

体外反应体系中APC/C活性及相关研究

为获得具有细胞周期后期促进复合物（APC/C）活性的细胞裂解液并建立APC/C体外活性检测体系,以其底物Cyclin B及Securin的降解为检测指标,分别从细胞阻滞于有丝分裂期的时间, UBCH10（APC/C的E2酶）的浓度以及裂解液浓度等几个方面研究了各种处理因素对APC/C活性的影响,并且用体外翻译底物验证了其活性及相关结论。此项工作为进一步探索APC/C相关分子事件奠定了基础。