人角膜内皮细胞株的建立与组织工程人角膜内皮的体外重建

为了体外重建出可用于角膜移植的组织工程人角膜内皮（TE—HCE）,本文从业已建立的非转染人角膜内皮（HCE）细胞系中筛选出单克隆细胞株（mcHCE）,并以其为种子细胞对TE—HCE的体外重建进行了研究。经有限稀释法从非转染HCE细胞系筛选出了mcHCE细胞株,形态结构、染色体分析以及细胞连接蛋白和膜运输蛋白的检测结果显示,mcHCE2401单克隆细胞株细胞具有正常而稳定的形态、结构和二倍染色体核型,并能表达细胞连接蛋白和膜运输蛋白,具有TE—HCE种子细胞的理想特征。以mcHCE2401细胞为种子细胞、以去上皮层修饰羊膜（mdAM）为载体支架体外重建出了TE—HCE,形态结构鉴定结果显示,多角形mcHCE2401种子细胞在mdAM上形成了连续、完整的细胞单层,在细胞之间以及细胞与mdAM之间均形成了广泛的细胞连接,单层细胞密度高达（3602．22±45．22）个／mm2（相当于0～3岁孩童HCE的细胞密度）,所重建单层角膜肉皮的形态结构与在体HCE高度近似。可见,本文成功建立了形态结构、核型以及功能蛋白表达正常的单克隆细胞株,并利用mcHCE2401细胞和mdAM在体外成功重建出了形态结构与与在体HCE高度近似的最“年轻”的TE—HCE,有望作为捐献角膜内皮的等效替代物用于角膜内皮异常疾病的临床治疗。     

蟾蜍（Bufo japonicus）细胞溶素基因筛选用探针的制备

利用阴离子交换、凝胶过滤和高压液相柱层析对细胞溶素基因进行了纯化，获得了纯度极高的酶样品。经ｌｙｓｉｌ内肽酶进行定点酶切后，利用高压液相柱层析纯化出了该酶的多个短肽片段。其中，经测序获得了３个短肽片段的氨基酸序列。根据两栖动物中密码子的使用频率，可推测出其相应的ｃＤＮＡ的核苷酸序列，进而制备出了３个ｃＤＮＡ探针。利用这些合成的探针，便可从精子ｃＤＮＡ文库中筛选细胞溶素基因。     

仙客来(Cyclamen persicum Mill)体细胞胚的发生及组织细胞学的研究

以仙客来开花植株新生叶片为外植体,成功诱导、筛选出体细胞胚发生的胚性愈伤组织,胚性愈伤组织的形态有两种：微棕红色松软愈伤和松脆愈伤.显微镜下观察松软胚性愈伤多为含有数十个胚性细胞的胚性细胞团,而松脆胚性愈伤的胚性细胞团的胚性细胞数目只有几个或十几个.细胞学观察二者均包含前胚性细胞团、二细胞、四细胞、八细胞,进一步继代培养2周可观察到多细胞原胚、球形胚、梨形胚、心形胚、鱼雷胚的出现,大多数体胚60～90 d可发育成完整的小植株.     

水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗肿瘤活性研究

为利用废弃海星壳资源开发出纯天然抗肿瘤药物,通过AB-8型吸附树脂、常压硅胶与Sephadex LH-20葡聚糖凝胶的柱层析技术,从罗氏海盘车(Asterias rollestoni Bell)壳的水抽提液中分离纯化出水溶性海星皂苷,并对其体内外抑瘤活性进行了研究。分离纯化与性质鉴定的结果显示,所得水溶性海星皂苷的性质隶属于甾体皂苷,其纯化样品的纯度可高达99.6％;体外抑瘤活性检测结果证实,所得皂苷纯品对HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、A-549肺癌细胞和Bel 7402肝癌细胞均具有显著的抑制活性。50mg／L皂苷对这4种癌细胞的抑制率分别为(92.06±2.60)％、(95.22±2.87)％、(95.04±3.30)％和(91。60±4。30)％,其IC50值分别为7.05、5.28、5.32、6.16mg／L。体内抑瘤活性检测结果证实,灌胃剂量为2、 5、 10μg／g的皂苷纯品对S180实体瘤荷瘤小鼠均具有显著的抑制活性,并具有浓度依赖性,10μg／g皂苷纯品的抑瘤率可高达46.27％,高于10μg／g抗肿瘤药物环磷酰胺(CTX)的抑瘤率(41.04％);同时,2、 5、 10μg／g的皂苷纯品还均能浓度依赖性地显著提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数。     

利多卡因对人角膜上皮细胞的毒性作用及其机理研究

利用不同浓度利多卡因（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）处理体外培养的人角膜上皮（ＨＣＥＰ）细胞系细胞,利用光镜观察、ＭＴＴ、荧光染色、ＤＮＡ电泳、ＴＵＮＥＬ、流式细胞仪和透射电镜方法研究了利多卡因对 ＨＣＥＰ细胞的毒性作用及其机理。光镜观察和 ＭＴＴ检测结果显示,质量浓度 １２５～１０００ｇ／Ｌ的利多卡因对 ＨＣＥＰ细胞具有显著的毒性作用,并具有浓度和时间依赖性;ＡＯ／ＥＢ荧光双染色结果显示,质量浓度 ０６２５～１００００ｇ／Ｌ的利多卡因可引起 ＨＣＥＰ细胞的质膜通透性显著提高,细胞凋亡率也具有浓度和时间依赖性;ＤＮＡ电泳和 ＴＵＮＥＬ检测结果显示,利多卡因能引起 ＨＣＥＰ细胞发生 ＤＮＡ断片化;ＴＥＭ观察结果显示,利多卡因能引起 ＨＣＥＰ细胞的超微结构出现了凋亡细胞的形态结构特征,如胞质空泡化、染色质浓缩、线粒体膨胀且嵴的结构紊乱、出现凋亡小体等;ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色的流式细胞仪检测结果显示,利多卡因能引起 ＨＣＥＰ细胞质膜中的磷脂酰丝氨酸（ＰＳ）发生外翻变化;ＥＬＩＳＡ检测结果显示,利多卡因还能引起 ＨＣＥＰ细胞中胱冬肽酶3、8、9、10表达量的增加,表明利多卡因确能引起 ＨＣＥＰ细胞发生细胞凋亡,而不是细胞坏死。由此可见,利多卡因在质量浓度大于 0.625ｇ／Ｌ时对 ＨＣＥＰ细胞具有显著的细胞毒性,并具有浓度和时间依赖性,且其毒性作用的发挥是通过诱导细胞凋亡实现的,在眼科临床应用中具有很大的毒副作用,应谨慎使用。     

仿刺参加工废液中几种海参皂苷化合物的分离鉴定

为高值化利用海参加工废弃液资源,对废弃液中皂苷类化学成分进行了研究。运用大孔吸附树脂层析、硅胶柱层析、制备高效液相色谱等技术从仿刺参加工废液中分离得到5个海参皂苷类化合物,采用现代波谱技术(MS,NMR等)并与文献报道数据进行比较分别鉴定为:holotoxin D(1)、holotoxin B1(2)、holotoxin A(3)、holotoxinA1(4)和cladoloside B(5)。这些化合物均系首次从仿刺参加工废液资源中分离得到,为海参加工废液的合理开发与利用奠定基础。     

氯化镉对条斑星鲽卵巢细胞的毒性作用及其机理研究

使用不同浓度的氯化镉（CdCl2）处理体外培养的条斑星鲽卵巢（BFO）细胞系细胞,利用毒理学和细胞生物学方法研究了重金属镉对BFO细胞的细胞毒性及其作用机理。毒性作用研究结果显示,BFO细胞对CdCl2敏感,浓度大于10ixmol／L的CdCl2对细胞的生长具有显著的抑制作用,能引起细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GST—Px）活性的持续降低和丙二醛（MDA）含量的持续升高,且具有浓度依赖性;机理研究结果显示．浓度大于40μmol／L的CdCl2可引起BFO细胞出现典型的凋亡细胞形态,BFO细胞在AO／EB荧光双染色中的质膜通透性显著提高,在单细胞凝胶电泳中出现明显的彗尾,且细胞凋亡率、彗尾的长度和亮度随CdCl2浓度的增加而逐渐升高,并具有浓度依赖性。可见,镉对BFO细胞具有显著的毒性作用,其毒性作用是通过诱导细胞凋亡来实现的,为利用BFO细胞系研究镉等重金属的细胞毒性及其作用机理奠定了基础。     

仙客来(Cyclamen persicum Mill)体细胞胚的发生及组织细胞学的研究

以仙客来开花植株新生叶片为外植体,成功诱导、筛选出体细胞胚发生的胚性愈伤组织,胚性愈伤组织的形态有两种:微棕红色松软愈伤和松脆愈伤.显微镜下观察松软胚性愈伤多为含有数十个胚性细胞的胚性细胞团,而松脆胚性愈伤的胚性细胞团的胚性细胞数目只有几个或十几个.细胞学观察二者均包含前胚性细胞团、二细胞、四细胞、八细胞,进一步继代培养2周可观察到多细胞原胚、球形胚、梨形胚、心形胚、鱼雷胚的出现,大多数体胚60～90 d可发育成完整的小植株.