圆二色谱法分析金属离子对鲍鱼脯氨酰内肽酶的作用

使用原核表达系统表达了皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP),并对其进行高度纯化。SDS-PAGE结果表明,该酶的相对分子质量约为85 ku,其二级结构主要由α-螺旋(28.3%)、反向平行结构(17.4%)、平行结构(8.70%)、β转角(19.0%)、无规卷曲(28.5%)组成。选取PEP特异性荧光底物Suc-Gly-Pro-MCA测定其活性,并选取了多种常见金属盐溶液对其进行抑制作用分析。结果发现,Al~(3+)、Cu~(2+)、 Zn~(2+)、Ag~+和Pb~(2+)能够抑制PEP的活性。利用圆二色谱法,对金属离子作用下PEP的二级结构变化进行分析和计算。分析结果表明,不同金属离子对PEP的作用效果不同:Al~(3+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)在影响PEP结构时也影响其活性;Ca~(2+)、Mg~(2+)对PEP的结构和活性均不产生明显影响,而Ag~+和Pb~(2+)可在不影响PEP二级结构的前提下抑制其活性。     

褶牡蛎氨肽酶B的分离纯化和性质研究

氨肽酶是一类能特异水解蛋白质N端氨基酸残基的外切酶,在食品行业有着广阔的应用前景。以褶牡蛎(Alectryonella plicatula)为原料,通过硫酸铵盐析,DEAE-sepharose,phenyl-sepharose及羟基磷灰石柱层析,分离纯化得到了一种高效水解碱性氨基酸的氨肽酶,其活性能被氨肽酶特异性抑制剂bestatin有效抑制。双向电泳结果显示该酶的分子质量约为100ku,pI约为5.8。通过肽质量指纹图谱对其进行鉴定得到12个肽段,共含138个氨基酸残基,这些氨基酸序列与太平洋牡蛎中嘌呤霉素敏感性氨肽酶一致,表明纯化的酶为氨肽酶B。褶牡蛎氨肽酶B的二级结构以无规卷曲与反向平行为主,其中无规卷曲占42.6%,反向平行占32.0%。动力学研究获得其K_m和k_cat值分别为1.5μmol/L和117.5s-1,k_cat/K_m为78.3L/(μmol·s)-1。在35℃,pH值 7.0的条件下,该酶具有最大催化活性,能高效水解氨肽酶底物Lys-MCA和Arg-MCA,释放出游离态的Lys和Arg,推测与牡蛎呈味相关。