兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立

目的 建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法 本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域，设计3对特异性引物，以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法优化引物浓度，构建kmt1、nuc和kh1基因的重组质粒标准品pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp,确定最小检测量；以兔源支气管败血波氏杆菌和产气荚膜梭菌等9种病原体核酸样本确定多重PCR法的特异性；通过批间和批内实验验证其重复性；经检测疑似感染的临床样本与已报道的检测方法进行比较，评估其临床应用效果。结果 最适退火温度为54.5℃;扩增kmt1和nuc基因的引物最适浓度均为1μL(10μmol/L),扩增kh1基因的引物最适浓度为0.5μL(10μmol/L);pMD-Pm最低检测限为20.6 copies/μL,pMD-Sa最低检测限为18.2 copies/μL,pMD-Kp最低检测限为23.2 copies/μL,表明其灵敏性高；该方法仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增条带，对其他病原体均无扩增条带，表明特异性较强；...