细胞自噬与高迁移率族蛋白B-1(HMGB1)介导肿瘤耐药的研究进展

恶性肿瘤可通过多种细胞机制,产生对抗癌药物和放疗的抗性,即所谓耐药现象.细胞自噬是肿瘤细胞耐药的一个重要原因.高迁移率族蛋白B-1(HMGB1)是高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白,在DNA结构、基因转录、基因重组、DNA损伤修复以及细胞存活等方面发挥重要的调控作用;HMGB1在细胞内的功能,与其氧化还原状态和细胞定位息...     

负载野生型p53抗原肽HLA-A~*2402四聚体的制备和鉴定

目的:制备负载野生型p53抗原肽的HLA-A*2402四聚体,用于检测卵巢肿瘤患者p53特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法:在p53125-134抗原肽TYS和轻链β2微球蛋白存在时,利用稀释法复性获得负载p53125-134抗原肽(TYSPALNKMF,TYS)的可溶性单体,经生物素酰化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成HLA-A*2402/TYS四聚体,以流式细胞仪检测特异性CTL的频率。结果:流式细胞术分析显示,卵巢癌患者外周血中可检测减低频率的p53125-134TYS抗原肽特异性CTL。结论:成功制备HLA-A*2402/TYS四聚体。     

大鼠心脏异位移植模型的建立

目的:为研究移植免疫建立大鼠心脏异位移植模型。方法:采用Ono's方法建立大鼠心脏异位移植模型,用大鼠的升主动脉和肺主动脉分别与大鼠的腹主动脉和下腔静脉作端侧吻合,同时使用两台单道心电图机描记受体双心和移植心脏的心电图。结果:从2001年11月到2003月1月共进行了248例大鼠心脏异位移植,其中179例手术供受体均用SD大鼠;69例手术供体为SD大鼠,受体为Wistar大鼠。开始的56例同种移植手术时间超过3h,受体均死亡;随后的82例同种移植手术时间在80～150min,受体存活13例,但移植心脏复跳的只有3例;最后手术时间缩短至45～65min时,手术成功率达到85%。同种移植心脏存活时间为(57±33)d,异种移植心脏存活天数(未使用免疫抑制剂治疗)为(7±1 53)d。结论:缩短手术时间是提高心脏移植成功率的关键。     

吲哚胺2,3-双加氧酶下调HLA-Ⅰ类分子的表达

目的:探讨人类吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)对细胞表面HLA-Ⅰ类分子的影响.方法:用脂质体法将含IDO基因的重组质粒pEGFP-IDO转染293T细胞,用Western blot检测IDOGFP在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-Ⅰ类分子的表达.结果:Western blot证实转染重组质粒的细胞表达IDO.转染空载体的细胞与转染重组质粒的细胞HLA-A,B,C-PE染色的平均荧光强度分别为299.46±62.65及42.51±8.19,两者相比有显著性差异(P＜0.01);转染重组质粒的细胞,未加色氨酸组与色氨酸组HLA-A,B,C-PE染色的平均荧光强度分别为309.17±34.89及692.12±33.42,两者相比亦有显著性差异(P＜0.01).结论:IDO下调细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达,色氨酸能够逆转IDO所致的HLA-Ⅰ类分子的下调.     

PKCθ-EGFP融合蛋白在HeLa细胞中的表达及其对细胞形态的影响

目的:分析增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与蛋白激酶C-θ(PKCθ)的融合蛋白(PKCθ-EGFP)在HeLa细胞中的表达、亚细胞定位及其对细胞形态的影响。方法:用脂质转染胺(Lipofec-tAMINE 2000)为载体分别以pPKCθ-EGFP和pEGFP-N1转染HeLa细胞,流式细胞仪分析其表达率,激光共聚焦显微镜分析其亚细胞定位,同时分析二丁酸佛波醇酯(PDB)和小檗碱对其亚细胞定位和细胞形态的影响。结果:转染pEGFP-N1或pPKCθ-EGFP的HeLa细胞48 h后,表达绿色荧光的细胞百分率分别为(70.9±4.4)%和(45.8±2.3)%(P<0.05)。表达的PKCθ-EGFP融合蛋白均匀分布于细胞内,与EGFP蛋白在细胞内的分布相似。PDB刺激30 min后,表达PKCθ-EGFP的HeLa细胞的形态发生显著变化,即由原来的梭形变成圆形,荧光强度增强。但表达EGFP的HeLa细胞的形态及荧光分布均不受影响。小檗碱对PDB诱导的HeLa细胞的形态和EGFP-PKCθ融合蛋白的分布无明显影响。结论:表达PKCθ-EGFP融合蛋白的HeLa细胞在PDB作用下细胞形态发生显著变化。     

负载SIV抗原肽的中国恒河猴Mamu-B~* 1703可溶性单体及其四聚体的制备和鉴定

目的:制备负载SIV抗原肽的中国恒河猴Mamu-B*1703可溶性单体及其四聚体.方法:以含Mama-B*1703重链cDNA序列的pMD19-T克隆为模板,通过PCR的方法克隆Mama-B*1703重链基因,进而构建羧基端融合生物索化酶BirA底物肽(BSP)的Mamu-B*1703重链胞外域融合蛋白的表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.β微球蛋白、SIV抗原肽共存时,通过稀释法复性可溶性Mamu-B*1703单体,经生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4:1的比例混合形成四聚体.结果:ELISA检测显示获得具有正确构象的负载SIV抗原肽的Mamu-B-1703四聚体.结论:印度恒河猴Mamu.B}1701特异性抗原肽IW9,与中国恒河猴的Mamu-B*1703相结合形成可溶性Mamu-B*1703/IW9单体和四聚体.     

OX40L在小鼠B16黑素瘤细胞中表达及对活化淋巴细胞凋亡影响

目的:构建OX40L的真核表达载体,分析其在B16细胞中的表达,研究OX40L对活化T淋巴细胞凋亡的影响.方法:以小鼠C57BL/6脾脏的cDNA为模板,PER扩增小鼠OX40L基因,构建真核表达载体pVAX1-OX40L,转染B16细胞后,荧光染色检测OX40L的表达;利用AnnexinV-PE凋亡试剂盒,检测B16黑素瘤细胞-淋巴细胞体外混合培养中对活化淋巴细胞凋亡的影响.结果:成功构建OX40L的真核表达载体,并转染B16细胞中,流式细胞术和激光共聚焦显微术均可检测到OX40L表达于B16细胞表面.淋巴细胞体外混合培养显示,表达OX40L的B16细胞组活化淋巴细胞的凋亡率为6.57%,而空质粒转染组为17.24%.结论:OX40L能表达于B16细胞表面,并能显著抑制活化淋巴细胞凋亡.     

瘦素基因佐剂对小鼠抗原提呈细胞表型的影响

目的:研究瘦素(Leptin)基因佐剂在体内对抗原提呈细胞的影响。方法:根据小鼠瘦素基因设计引物,采用RT-PCR方法获得瘦素cDNA,与pVAX1连接构建瘦素真核表达载体作为基因佐剂,制备无内毒素重组质粒,转染B16细胞鉴定瘦素的表达,并采用肌注方式分析瘦素基因佐剂在体内对小鼠抗原提呈细胞表型的影响。结果:克隆得到的瘦素编码区全长序列,经DNA测序后证明与已报道序列相同,成功构建小鼠瘦素的真核表达载体,可在B16细胞表达;瘦素基因佐剂在体内对CD3-CD19-CD11c+细胞的MHC II和CD83的表达无明显影响,但能显著上调CD3-CD19-CD11c-免疫细胞表面MHC II类分子的表达。结论:成功构建小鼠瘦素基因佐剂,体内试验可促进免疫细胞上调MHC II类分子,提示瘦素基因佐剂有可能通过增强免疫细胞尤其是抗原提呈细胞的活化而促进免疫应答。     

HLA-A*0207重链胞外区原核表达载体的构建及表达

目的：克隆HLA-A*0207(A2)重链基因，构建在羧基端融合生物索化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide，BSP)的A2重链胞外区原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2^ 供白细胞中克隆A2基因并进行DNA测序，并以PCR方法构建在羧基端融合BSP的A2重链胞外区表达载体，在大肠杆菌B121(ED3)中进行表达。结果：从31名HLA-A2^ 供白细胞中克隆到的基因经DNA测序显示，只有从供2得到的基因是HLA-A*0207。将编码该基因编码重链胞外区1-275的序列和编码BSP的序列融合，构建融合蛋白表达载体，并以测序验证。融合蛋白在B121(ED3)中获得高效表达，产物相对分子质量为35000，约占菌体总蛋白的30％，主要存在于包涵体中，对包涵体进行洗涤后得到纯度为80％的重组蛋白。结论：成功克隆HLA-A*0207基因，构建了其胞外区和BSP融合蛋白表达载体并在大肠杆菌中获得高效表达。     

人白细胞介素7重组蛋白原核表达载体在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的:构建重组人白细胞介素7(rhIL-7)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并鉴定.方法:以RT-PCR方法扩增编码IL-7的cDNA片段,插入至pET-3d载体中,构建rhIL-7的原核表达载体,阳性克隆经测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3),优化rhIL-7表达条件,利用免疫印迹鉴定重组蛋白.结果:重组载体经DNA测序显示包含正确的rhIL-7编码序列,重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导后外源蛋白表达,相对分子质量为17 400,与IL-7理论分子质量一致;免疫印迹显示,外源蛋白可以被人IL-7特异性抗体识别,表明在原核表达的外源蛋白是rhIL-7.rhIL-7主要表达于包涵体中,包涵体表达优化条件为:温度为37 ℃、IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为4 h.结论:成功的构建了rhIL-7的原核表达载体.