新生小鼠脊髓神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的从新生小鼠脊髓分离、培养神经干细胞,并对其增殖、分化特性进行鉴定,为进一步研究脊髓神经干细胞的移植疗法奠定基础。方法在显微镜下取6只新生小鼠的脊髓组织,采用酶消化法联合机械法将其制备成单细胞悬液,并在无血清培养基中培养。应用CD133染色、巢蛋白染色后Hoechst33258对细胞核染色;Brd U标记后行巢蛋白染色、微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白染色,Hoechst33258复染胞核;对干细胞及其分化产物进行鉴定。结果从小鼠脊髓中分离出的神经干细胞CD133、巢蛋白染色反应阳性;贴壁神经球巢蛋白染色阳性;其诱导分化产物微管蛋白和胶质纤维酸性蛋白染色阳性。结论采用酶消化法联合机械法对脊髓神经干细胞行传代和培养,能够成功获得具有增殖分化特性的干细胞。     

骨髓间充质干细胞的培养及其体外标记跟踪的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离培养;观察Brdu、DAPI以及Hoechst33342体外染色的合适时间和最佳剂量,比较三种方法的优缺点。方法 BMSCs取自SD雄性大鼠的股骨和胫骨,然后采用贴壁分离培养法对BMSCs进行分离培养,当BMSCs培养至第三代时,采用流式细胞仪对其表面抗原CD34、CD44、CD45进行测定;同时分别用Brdu、DAPI以及Hoechst33342对BMSCs进行染色标记,Brdu标记效果用免疫细胞化学方法检测,DAPI和Hoechst33342的标记率用荧光显微镜观测,最后用MTT检测BMSCs的细胞增值率,观察三种不同方法体外染色的合适时间和最佳剂量,同时比较其优缺点。结果流式细胞仪检测发现BMSCs表达CD44阳性,CD34和CD45阴性;BMSCs染色前后其表面标志表达无明显统计学差异(P0.05);Brdu染色标记BMSCs的最佳浓度和时间是10μmol/L、48小时;DAPI染色标记BMSCs的最佳浓度和时间是20μg/ml、30分钟;Hoechst33342染色标记BMSCs的最佳浓度和时间是5μg/ml、1小时。结论采用粘附贴壁分离培养法能够有效获取高纯度的BMSCs;运用Brdu、DAPI以及Hoechst33342三种方法标记BMSCs效果良好,方法可靠、合理,为研究BMSCs体内追踪打下了基础。     

无血清分离人结直肠癌细胞的体外培养形态及标志物表达特征

目的探讨人结直肠肿瘤干细胞在体外分化过程中细胞形态和干细胞相关标志物CD133的表达变化,为进一步研究结直肠肿瘤干细胞分化走向提供实验依据。方法取来源于人结直肠癌的细胞系HCT116,无血清培养分离出CD133+细胞,加血清诱导分化,相差显微镜下观察其形态变化;在未分化状态下无血清培养第7天和14天与血清诱导分化后收集细胞,利用流式细胞仪检测干细胞标志物CD133的表达量,采用激光共聚焦检测CD133表面标记分子的表达。结果 1)细胞形态:无血清培养分离的CD133+细胞,在生长过程中聚集成规则的细胞球,血清诱导后即贴壁生长,贴壁形态与同来源细胞形态一致,且再次无血清悬浮培养后聚集成球稳定生长。2)标志物变化:结直肠肿瘤干细胞未分化时CD133表面标记分子高表达,流式细胞仪检测未分化细胞CD133第7天表达率为(20.4±0.52)%,第14天表达率为(78.5±2.80)%,分化后表达率为(0.50±0.17)%。结论细胞形态和标志物表达改变均表明高表达CD133+的HCT116结直肠癌肿瘤干细胞可定向分化为同源的结直肠癌细胞,CD133+细胞经血清诱导后表达下调而使细胞失去干细胞特性。     

结肠腺癌中结肠癌干细胞的分离、鉴定

目的从人结肠腺癌组织中分离、鉴定结肠癌干细胞，并初步观察其生物学特性。方法利用新鲜结肠腺癌组织，无血清悬浮成球培养，流式细胞检测ESA、CD44表达情况，体外观察其诱导分化及CK20、Muc表达情况，Balb／C小鼠移植观察其成瘤情况。结果从人原代结肠腺癌中分离、纯化EpCAM^high CD44^＋结肠癌干细胞，结肠癌原代细胞中EpCAM^highCD44^＋细胞比例为1．7％～38％（平均5．4％）。单克隆形成实验证实结肠癌组织中存在肿瘤干细胞。其比例为（2．07±0．11）％，分离获得的EpCAM^highCD44^＋细胞能在无血清培养基中“成球”，在血清诱导下能贴壁分化；将EpCAM^highCD44^＋细胞移植在Balb／C裸鼠体内，表现出很强的致瘤性，移植瘤中EpCAM^highCD44^＋细胞比例为3．6％～43．2％（平均15．2％），所有的移植瘤经组织学测定，均形成腺管样结构，表达结肠特异性分化标志物CK-20、中性上皮粘蛋白（neutral epithelial mucins，Muc）。结论人结肠腺癌组织中存在EpCAM^highCD44^＋细胞群，具有和普通干细胞相类似的无限增殖、自我更新和分化能力。     

人结肠癌CW-2干细胞获取方法研究

目的运用3种不同的方法分离纯化人结肠癌CW-2干细胞，并对其分离纯化效率进行比较，探讨获得癌干细胞的有效方法。方法采用单纯无血清悬浮培养、无血清悬浮培养联合化疗药物、流式细胞分选技术分别富集人结肠癌细胞株CW-2干细胞；然后运用流式细胞术、NOD—SCID小鼠致瘤实验和Transwell侵袭实验分析比较3种方法的富集效率。结果无血清悬浮培养细胞．无血清悬浮培养联合化疗药物处理细胞和流式细胞仪分选技术分选后细胞中具有结肠癌干细胞特性的CD44＋EPCAM_细胞分别为（59．39±4．55）％、（74.36±6．78）％、（86．43±8．43）％；3群细胞的成瘤能力和侵袭能力都存在显著统计学差异（P值〈0．05）：流式细胞分选技术分选后细胞〉无血清悬浮培养联合化疗药物处理细胞〉单纯无血清悬浮培养细胞。结论流式细胞分选技术富集癌干细胞的能力强于单纯无血清悬浮培养和无血清悬浮培养联合化疗药物，无血清悬浮培养联合化疗药物又强于单纯无血清悬浮培养。     

肝癌细胞系Hep3B中CD133+细胞亚群的分离及其特性的研究

目的研究CD133在人肝癌细胞系Hep3B中的表达以及CD133+细胞的体外增殖、自我更新及体内成瘤能力，初步探讨肝癌中CD133+细胞亚群的干细胞特性。方法流式细胞仪检测未分选的Hep3B细胞中CD133+细胞表达情况；免疫磁珠分选技术纯化CD133+肿瘤细胞；MTT法检测CD133+细胞体外增殖能力；无血清培养纯化...     

神经干细胞对创伤性脑损伤的修复作用

目的建立小鼠创伤性脑损伤动物模型,进行神经干细胞移植,以评价神经干细胞对创伤性脑损伤的修复作用。方法体外培养神经干细胞并进行标记、鉴定,采用改良的Feeney氏自由落体法撞击构建创伤性脑损伤动物模型,脑外伤后1d进行神经干细胞移植,分别在移植当天(移植后0 d)、移植后3 d、7 d、14 d、21 d进行神经功能损伤程度(NSS)评分及疲劳转棒测试,移植后7 d、21 d进行抗Brdu、Nestin、GFAP、β-TubulinⅢ免疫荧光染色。结果移植后7 d、14 d、21 d神经干细胞移植组的NSS评分低于对照组,有统计学差异(P0.05);移植后14 d、21 d神经干细胞移植组的疲劳转棒时间长于对照组,有统计学差异(P0.05);移植后7 d免疫荧光染色发现BrdU/Nestin双阳性细胞,移植后21 d免疫荧光染色发现BrdU/GFAP双阳性细胞及BrdU/β-TubulinⅢ双阳性细胞。结论神经干细胞移植能够改善创伤性脑损伤后的神经功能,移植的神经干细胞能够在宿主脑内存活、迁移并在受损区域分化成星形胶质细胞和神经元。     

小型猪骨髓间充质干细胞经心导管冠状动脉移植及其迁移和分化的研究

目的建立小型猪心导管介入冠状动脉治疗模型，为骨髓间充质于细胞（MSCs）移植治疗心血管疾病提供新的方法，观察骨髓间充质干细胞经心导管介入冠状动脉移植后在心肌内的迁移及分化。方法选用冠状动脉解剖生理特点与人类相似的小型猪，应用心导管介入技术将体外培养扩增的小型猪自体MSCs移植进入左冠状动脉前降支，用免疫荧光检测即刻移植和移植后6W移植细胞的肌钙蛋白T（cTnT）、缝隙连接蛋白43（Cx43）、anti－Ⅷfactor的表达。结果成功的完成了小型猪心导管介入冠状动脉进行自体骨髓间充质干细胞移植。移植细胞存活，向心肌组织迁移，并向心肌细胞和毛细血管方向分化。结论该方法稳定，技术先进。可进行准确的定位和动态观测，为临床应用提供了一个可靠的技术平台。MSCs移植后在心肌内发生迁移及分化。     

青蒿水提液对肺癌A549细胞的影响

目的研究青蒿水提液对肺癌A549细胞株增殖的影响和诱导凋亡的情况。方法不同浓度青蒿水提液作用于细胞不同时间，四甲基氮噻唑蓝（MTT）法检测吸光度值（A490nm）并计算增殖抑制率；AnnexinV-FITC／PI荧光染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率；并以荧光显微镜观察细胞形态改变情况；蛋白质印迹法分析细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表这。结果青蒿水提液呈时间和剂量依赖性抑制A549细胞增殖；荧光显微镜下A549细胞出现不同时期凋亡特征性改变；流式细胞仪检测细胞凋亡率随着药物浓度增加而升高；A549细胞株的Bax蛋白表达量增多、Bcl-2蛋白表达量下降。结论青蒿水提液促进体外培养的A549细胞株增殖抑制并诱导凋亡，其机制可能与A549细胞Bax表达上调和Bcl-2表达下调有关。     

解聚复肾宁对糖尿病肾病大鼠TNF—OL、MCP-1的影响

目的观察解聚复肾宁（Jiejufushenning，JJFSN）对糖尿病（Diabetes mellitus，DM）大鼠肾组织肿瘤坏死因子-α（Tumorneerosisfactor-alpha，TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和血清TNF-α的影响，探讨其肾保护作用机制。方法腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）建立SD大鼠DM模型，将成模DM大鼠随机分为3组：DM模型组（B组）、JJFSN组（C组）、厄贝沙坦（Irbesartan）组（D组），另设正常对照组（A组）。采用相应干预措施处理12周。常规方法测定12周末各组大鼠空腹血糖（FBG）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、肾重／体重（KW／BW）、24h尿蛋白（24huFro）；放免法测血清TNF-α含量：免疫组织化学方法测肾组织TNF—Ot、MCP-1的表达；PAS染色评估细胞外基质；电镜观察肾组织超微结构改变。结果与A组相比．B组大鼠FBG、BUN、Scr、KW／BW、24huPro及血清TNF-α升高（P〈0．05），肾组织TNF—Ot、MCP-1表达明显增高（P〈0．05）；肾组织超微结构明显异常；C组和D组上述指标显著改善（P〈0．05），肾组织超微结构异常改善。结论竹FSN能延缓DM大鼠肾损害进程，其机制可能与抑制TNF-α、MCP-1上调有关。     

Injury-induced neurogenesis in the mammalian forebrain

It has been accepted that new neurons are added to the olfactory bulb and the hippocampal dentate gyrus throughout life in the healthy adult mammalian brain. Recent studies have clarified that brain insult raises the proliferation of neural stem cells/neural progenitor cells existing in the subventricular zone and the subgranular zone, which become sources of new neurons for the olfactory bulb and the dentate gyrus, respectively. Interestingly, convincing data has shown that brain insult invokes neurogenesis in various brain regions, such as the hippocampal cornu ammonis region, striatum, and cortex. These reports suggest that neural stem cells/neural progenitor cells, which can be activated by brain injury, might be broadly located in the adult brain or that new neurons may migrate widely from the neurogenic regions. This review focuses on brain insult-induced neurogenesis in the mammalian forebrain, especially in the neocortex.     

儿茶素对晚期糖基化终末产物诱导的内皮细胞凋亡的干预作用

目的探讨儿茶素对晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导内皮细胞凋亡的干预作用。方法糖孵育法制备晚期糖基化终末产物，分离肾血管内皮细胞，将内皮细胞分成空白对照组、AGE组、浓度分别为10、15、20μg／ml的儿茶素组共五组。实验末，采用AlamarBlue还原法测定同内皮细胞增生活力，TUNEL法测定细胞凋亡率，生化法测定培养上清中·OH、MDA浓度，RT-PCR测定Bcl-2mRNA表达，Western-Blotting测定Bcl-2蛋白活性。结果与对照组相比，AGE组内皮细胞增生活性、Bcl-2基因与蛋白活性显著降低（P均〈0．01）；凋亡率、·OH与MDA浓度显著增加（P均〈0．01）；与AGE组相比，儿茶素各浓度组内皮细胞增生活力与Bcl-2基因与蛋白活性表达增高，凋亡率、·OH与MDA浓度降低；儿茶素各剂量组之间呈浓度梯度效应。结论儿茶素可降低AGEs引起的血管内皮细胞凋亡，其机制可能是通过有效清除活性氧自由基、上调Bcl-2mRNA与活性蛋白表达，阻断内皮细胞内过氧化物的堆积二种途径实现的。     

氧化苦参碱对人宫颈癌SiHa细胞株增殖及凋亡的影响

目的研究氧化苦参碱对体外人宫颈癌SiHa细胞株增殖活性及凋亡的影响。方法对人宫颈癌SiHa细胞株进行体外培养,经氧化苦参碱处理的细胞组为实验组,未经处理组为对照组。采用MTT细胞存活实验检测氧化苦参碱对入宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖影响,并计算IC50;倒置相差显微镜下观察不同浓度的氧化苦参碱作用48h后SiHa细胞的形态改变;Hoechst33258染色法和Western blot法检测氧化苦参碱对SiHa细胞核及凋亡相关蛋白(P53、Bax及Bcl-2)表达水平的影响。结果 MTT结果显示氧化苦参碱剂量-时间依耐性抑制人宫颈癌SiHa细胞的体外增殖(P0.05),计算24 h、48 h和72 h的IC50分别为(1 028.41±3.57)μg/ml、(701.72±6.01)μg/ml和(406.88±2.15)μg/ml;氧化苦参碱处理48 h后,SiHa细胞的形态特征及数目发生显著变化,且随氧化苦参碱浓度的增加而愈加明显;Hoechst33258染色证实氧化苦参碱处理后SiHa细胞发生凋亡,可见典型的凋亡特征;Western blot结果证实氧化苦参碱(700μg/ml、1 600μg/ml)处理48 h后,和对照组比较,药物处理组细胞凋亡周期蛋白P53、Bax表达上调(P0.05),而Bcl-2表达下调(P0.05),Bax/Bcl-2的比率明显增加(P0.05)。结论氧化苦参碱可抑制体外人宫颈癌SiHa细胞的体外增殖活性发挥其抗肿瘤作用,其作用机制可能诱导SiHa细胞的凋亡有关。     

The positional identity of mouse ES cell-generated neurons is affected by BMP signaling

We investigated the effects of bone morphogenetic proteins (BMPs) in determining the positional identity of neurons generated in vitro from mouse embryonic stem cells (ESCs), an aspect that has been neglected thus far. Classical embryological studies in lower vertebrates indicate that BMPs inhibit the default fate of pluripotent embryonic cells, which is both neural and anterior. Moreover, mammalian ESCs generate neurons more efficiently when cultured in a minimal medium containing BMP inhibitors. In this paper, we show that mouse ESCs produce, secrete, and respond to BMPs during in vitro neural differentiation. After neuralization in a minimal medium, differentiated ESCs show a gene expression profile consistent with a midbrain identity, as evaluated by the analysis of a number of markers of anterior–posterior and dorsoventral identity. We found that BMPs endogenously produced during neural differentiation mainly act by inhibiting the expression of a telencephalic gene profile, which was revealed by the treatment with Noggin or with other BMP inhibitors. To better characterize the effect of BMPs on positional fate, we compared the global gene expression profiles of differentiated ESCs with those of embryonic forebrain, midbrain, and hindbrain. Both Noggin and retinoic acid (RA) support neuronal differentiation of ESCs, but they show different effects on their positional identity: whereas RA supports the typical gene expression profile of hindbrain neurons, Noggin induces a profile characteristic of dorsal telencephalic neurons. Our findings show that endogenously produced BMPs affect the positional identity of the neurons that ESCs spontaneously generate when differentiating in vitro in a minimal medium. The data also support the existence of an intrinsic program of neuronal differentiation with dorsal telencephalic identity. Our method of ESC neuralization allows for fast differentiation of neural cells via the same signals found during in vivo embryonic development and for the acquisition of cortical identity by the inhibition of BMP alone.     

EGCG通过TGF-β1信号通路抑制PLA-802细胞的机制研究

目的 观察表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)对人横纹肌肉瘤细胞株PLA-802的抑制作用,以及对细胞内TGF-β1/Smad4的表达的影响,探索EGCG抑制横纹肌肉瘤细胞生长的机制.方法 体外培养人横纹肌肉瘤细胞株PLA-802,并用不同浓度的EGCG作用不同的时间.用MTT检测EGCG对PLA-802细胞生长情况的影响,用流式细胞术检测细胞周期的变化情况,RT-PCR和Westernblot分别检测细胞内TGF-β1和Smad4的mRNA和蛋白水平的表达.结果 MTT结果显示EGCG显著降低了PLA-802细胞的存活率((P＜0.05).流式细胞结果表明EGCG明显降低了S期而增加了G1期(P＜0.05).而TGF-β1和其下游因子Smad4的mRNA和蛋白水平的表达也明显受到EGCG的抑制,且这种抑制作用呈浓度-时间依赖性(P＜0.05).结论 EGCG发挥其抑制PLA-802细胞的作用可通过抑制TGF-β1信号通路,这或许将为临床治疗横纹肌肉瘤提供新的思路.