抗稻瘟病水稻BAC文库的构建与鉴定

水稻是一种重要的粮食作物，同时也是一种重要的单子叶植物模式.稻瘟病是水稻生长中的一种严重病害，因此分离和克隆新的稻瘟病抗病基因具有重要的应用价值.以一个抗稻瘟病农家种水稻为材料，以plndigoBAC5为载体，构建了细菌人工染色体（BAC）文库.该文库共有90 000个转化子，插入频率99％，插入片段平均长度为105 kb，由此推测这个文库覆盖水稻基因组约20倍.利用其中的45 000个转化子建立了4维PCR筛选体系，并且通过4维PCR筛选体系，筛选获得了7个含水稻分蘖基因（MOC1）的阳性克隆.因此该文库是一个高质量、高覆盖率的水稻BAC文库，能有效用于目的基因的分离.     

水稻S_5区候选克隆R2I19的筛选及序列信息学分析

以水稻广亲和品种Cpslo17为材料 ,构建了一个覆盖 9倍核基因组的cosmid文库 ,其平均插入片段约4 0kb。以与广亲和位点紧密联锁的单拷贝分子标记BAC2 3D12的R末端为探针 ,从cosmid文库中筛选得到一个阳性克隆R2I19(～ 32kb)。结合S5位点的高密度连锁图和物理图谱 ,初步确定为S5区候选克隆。对该克隆的 2个TAC亚克隆TRW15 10 (～ 15kb)及TRW15 17(～ 15kb)进行了初步的生物信息学分析 ,证实与已知的水稻基因组序列有很高的同源性 ,并显示其中可能含有与水稻育性相关的基因。     

水稻S5区候选克隆R2I19的筛选及序列信息学分析

以水稻广亲和品种Cpslo17为材料，构建了一个覆盖9倍核基因组的cosmid库，其平均插入片段约40kb。以与广亲和位点紧密联锁的单拷贝分子标记BAC23D12的R末端为探针，从cosmid库中筛选得到一个阳性克隆R2I19（－32kb)。结合S5位点的高密度连锁图和物理图谱，初步确定为S5区侯选克隆。对该克隆的2个TAC亚克隆TRW1510（－15kb)及TRW1517(-15kb)进行了初步的生物信息学分析，证实与已知的水稻基因组序列有很高的同源性，并显示其中可能含有与水稻育性相关的基因。     

利迪链霉菌A02细菌人工染色体基因组文库的构建

 利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物真菌病害高效生防菌,其活性产物为安全高效广谱的抗真菌剂纳他霉素。为了克隆纳他霉素生物合成基因簇和调控其表达相关的功能基因,通过基因改良的方式进行A02的定向分子改造,提高纳他霉素的效价和产量,提取了利迪链霉菌A02的基因组DNA,用Hind III和Bam HI部分酶解后,回收了97~194kb和48.5~97kb大小的高分子量DNA,与质粒载体Copycontrol pCC1BAC连接,分别构建了含有800个和1500个克隆的两个BAC文库。从文库中随机挑选20个克隆,酶切检测平均插入片段分别为133kb和65kb,空载率小于1%,假定利迪链霉菌的基因组有8×10⁶kb,计算文库基因组覆盖率分别为12.28倍和11.25倍。因此,从文库筛选到目的片段的概率达99.99%以上。     

Cupriavidus metallidurans CH34中2个苯酚降解基因簇的筛选与功能鉴定

Cupriavidus metallidurans(C.metallidurans)CH34是一种重金属耐受性细菌,能在以苯酚、甲苯酚、苯甲酸、苯胺等芳香族化合物为唯一碳源和能源的培养基中生长,其基因组中含有2个苯酚降解基因簇.以载体pIndigo-BAC 5构建C.metallidurans CH34的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库,获得约3万个克隆,平均插入片段大小为30 kb,插入频率为98%,推测该文库覆盖CH34基因组约1 240倍.用PCR筛选文库中的3 000个单克隆,共获得9个阳性克隆,其中5个克隆含有长基因簇,4个含有短基因簇,并从中得到含有全长苯酚降解基因簇的克隆.利用以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基,研究2个基因簇在大肠杆菌中的表达情况.结果显示,两个基因簇均表现出了苯酚降解能力,短簇的降酚能力要优于长簇.     

中国美利奴细毛羊BAC文库的质量评价

从文库的平均插入片段大小、文库的覆盖率、文库克隆的稳定性对中国美利奴细毛羊BAC文库进行了质量评价.统计结果表明,文库的平均插入片段大小约为133kb, 非重组克隆占3.2%,文库在理论上约有8倍绵羊基因组覆盖率,从该文库中找到任意单拷贝序列的概率为99.93%.连续多次传代培养实验证实文库克隆的遗传稳定性好.     

黄瓜SRAP遗传连锁图的构建及始花节位的基因定位

在由黄瓜自交系S06与S52杂交产生的F2群体中,应用SRAP(sequence-related amplified polymorphism)标记构建黄瓜的分子遗传连锁图谱.使用了64个多态性引物组合,共得到108个多态性条带,单对引物组合最多的产生5个多态性条带,平均1.7个.在F2群体中对这些多态性位点进行连锁分析,并用Mapmaker 3.0构建连锁群,77个标记位点进入9个连锁群(LOD≥3.0),总长1114.2 cM,标记平均间距14.5 cM,标记均匀分布于整个连锁群.同时将始花节位性状控制基因ffn(first flower node)定位在第Ⅸ连锁群上,与两侧标记DC1EM5和ME7EM2A的距离分别为10.3和12.1 cM.     

活性污泥宏基因组Fosmid文库的构建

大插入片段宏基因组文库的构建是开发大片段目的基因及分析其结构与功能的基础.文中分别采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、试剂盒及琼脂糖包埋法提取活性污泥宏基因组DNA,其中琼脂糖包埋法获得的DNA片段大于23kbp,利用此DNA成功构建了以pCC1FOS为载体的Fosmid文库,该文库含有5280个克隆,平均插入片段长度为35～40 kbp,共包含约200 Mbp的宏基因组DNA.从此文库中随机挑选200个克隆,利用活性筛选方法快速筛选到了1个含有淀粉酶的阳性克隆,表明活性污泥Fosmid文库可用于功能基因的活性筛选,具有开发新基因的潜力.     

盐藻（Dunaliella viridis）细菌人工染色体文库的构建和鉴定

盐藻具有极强的耐盐能力，是研究植物耐盐机制的模式系统.为了对其耐盐机制进行深入的 研究，以pCC1BAC为载体，构建了盐藻的细菌人工染色体（BAC）文库.该文库共有9 216 个转化子，插入片段平均长度为55 kb，以单克隆形式保藏在96块96孔板中，并建立了四维P CR基因筛选体系，可以通过4轮PCR快速筛选获得阳性单克隆.根据本实验室分离到的两个盐 藻基因的cDNA序列（ DvSPT2和DvTPSP ）设计引物，通过PCR从该文库中各筛到4个阳性BA C克 隆，说明该文库能有效用于分离盐藻基因的基因组序列，据此推测该文库约覆盖4倍盐藻基 因组序列.     

与黄瓜耐高温QTL连锁的分子标记分析

耐高温性状对黄瓜的夏季生产具有重要意义.用耐高温自交系863-7和不耐高温自交系863-6构建F2群体.在生长箱中对群体进行高温胁迫处理一个月,测定其相对生长综合值作为耐高温性状值.用62对SSR引物和132对SRAP引物组合对亲本进行多态性筛选,8对SSR引物和71对SRAP引物组合呈现出多态性.对多态性的标记进行群体分组分析和选择性基因型分析,发现1个SSR标记和9个SRAP标记与黄瓜耐高温QTL连锁,对表型的贡献率在6%～17%.Mapmaker分析发现7个标记(CSCT335、ME10EM2-350、ME11EM2-640、ME11OD3-230、DC10D3-150、ME8EM10-590和ME8EM7-590)位于同一连锁群,2个标记(ME1EM6-670和ME9EM6-650)位于另一连锁群,标记ME9EM1-210不与其他标记连锁,它们代表的3个QTL累计的表型贡献率达32.3%.