复合微生物菌剂对玉米秸秆的预处理与厌氧产气性能的研究

利用乳酸菌、EM菌、黑曲霉、白腐菌、草酸青霉及木霉组成的复合微生物菌剂CM-2对玉米秸秆进行预处理试验与厌氧发酵产气试验。将复合微生物菌剂按比例加入玉米秸秆中处理30d,试验结果测得纤维素降解率达52.94%、半纤维素降解率为33.33%、木质素降解率为2.67%。经过复合微生物菌剂CM-2预处理后的玉米秸秆与牛粪按照1:2的比例,TS为15%、温度为35℃的中温厌氧发酵,其累积产气量提高30.18%,且开始产气时间提前2d,进入产气高峰的时间也提前4d,在产气高峰期的时间也可维持14d。此外经过复合微生物菌剂CM-2处理后的玉米秸秆在厌氧发酵产气高峰时的甲烷转化率也提高了12.87%。     

一种纤维素降解复合菌剂在羊粪堆肥中的应用效果评价

为进一步提高堆肥物料中纤维素的降解效率,缩短堆肥时间,研究将前期复配的纤维素降解复合菌剂M(M)接种羊粪和秸秆混合物,并开展好氧堆肥发酵试验,分析菌剂M羊粪堆肥发酵的效果.结果表明,添加菌剂M发酵后,与空白对照组(CK)相比,堆体的升温(50℃)时间缩短了1 d,高温阶段延长了2 d,腐熟周期缩短了4 d.堆肥结束(25 d)时,添加菌剂M处理组的碳氮比(12.77)显著低于CK组(16.44)(p0.05),而且种子发芽指数(98.20%)、全氮(23.37 g·kg~(-1))、P2O5(13.13 g·kg~(-1))、K2O(51.12 g·kg~(-1))、纤维素降解率(28.33%)和半纤维素降解率(38.32%)均显著高于CK处理组(p0.05),总养分(8.76%)达到国家有机肥料标准(≥5%).酶活测定表明,堆肥过程中,添加菌剂M处理组的滤纸酶(FPase)、羧甲基纤维素酶(CMCase)和β-葡萄糖苷酶(β-Gase)均显著高于CK处理组的(p0.05).其中,在发酵高温阶段(4～8 d)时的酶活最高,分别为57.80、10.41 U·mL~(-1)和75.77 U·mL~(-1).将菌剂M与市售促腐菌剂R(菌剂R)混合的菌剂MR堆肥,各项指标均优于菌剂M和菌剂R单一处理组的.除纤维素降解率外,菌剂M和菌剂R处理组的其它各项指标之间无显著差异(p0.05).试验利用复合菌剂M进行羊粪堆肥发酵可以明显降低堆体物料的纤维素和半纤维素,提高堆肥营养,缩短堆肥时间,发酵后的有机肥可用于农业生产.     

发酵水稻秸秆产酸复合菌群的筛选与评价

 为开发秸秆发酵生产有机挥发酸的微生物种子资源和研究材料,以牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、腐木以及猪粪堆肥和腐木混合物为接种物,通过传代富集培养,选育到发酵水稻秸秆产酸性能相对稳定的5个复合菌群,即FM_c、FM_d、FM_s、FM_w和FM_(d+w).经测试,FM_w具有最高的秸秆降解能力,其秸秆降解率可达46.4%;菌群FM_(d+w)发酵秸秆的总酸和丁酸比产率最高,分别为0.64和0.48g/g;发酵秸秆产乙酸能力以菌群FM_d最为突出,其乙酸比产率为0.35g/g.5个复合菌群均缺乏酸性纤维素酶活性,极大限制了秸秆降解率和产酸率,需要进一步的耐酸驯化和培养条件优化.     

蔬菜-花卉秸秆混合堆肥性状表征及纤维素分解菌群选育研究

利用小型堆肥反应器，以蔬菜和花卉先秸秆为堆肥生料，研究了蔬菜－花卉秸秆混合堆肥体系的动力学特征。结果表明，质量比为2：3的蔬菜和花卉秸秆在容积为100L的反应器中，通气量为0．3m^3h^-1的条件下能达到较理想的发酵状态。在秸秆堆肥体系中，以纤维素为惟一碳源筛选到一批具有较高纤维素降解能力的微生物菌，初步统计有32种表现型，其中7种为真菌，25种为细菌。通过微生物正交实验，得到4组高效组合菌剂（共15种表现型），能在3d内快速启动滤纸条降解。该研究为下一步花卉秸秆高效复合降解菌剂的研制，以及解决混合发酵过程中蔬菜和花卉秸秆发酵不同步问题提供前期基础。     

耐热菌剂对堆肥有机质降解及细菌演替的影响

针对传统堆肥周期长、有机质降解效率低的问题,将耐热复合菌剂接种于餐厨废弃物高温堆肥中,研究其对有机质降解及微生物群落动态变化的影响。结果表明,接种耐热复合菌剂有利于：有机质降解,堆肥细菌群落丰富度和多样性的提高,厚壁菌门(Firmicutes)和尿素芽胞杆菌属(Ureibacillus)相对丰度的提高,冗余分析的结果表明,厚壁菌门(Firmicutes)对有机质降解的影响最强;网络分析结果表明,堆肥过程中尿素芽孢杆菌属(Ureibacillus)相对丰度的增加以及乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度的降低促进了有机质的降解。因此,接种耐热复合菌剂可以提高高温堆肥的质量和效率。     

利用玉米秸秆生产单细胞蛋白关键技术研究

以农作物副产品玉米秸秆为研究对象,采用水解纤维素性能优良的绿色木霉(13001)及高产蛋白质的产朊假丝酵母(1769)为发酵生产菌株共同处理,生产蛋白质含量较高,富含多种矿物元素的单细胞蛋白产品。探讨了玉米秸秆预处理方法、绿色木霉接种工艺、纤维素降解工艺、不同氮源对玉米秸秆发酵糖化的影响,以及单细胞蛋白发酵工艺,通过对比试验确定了玉米秸秆最佳的预处理方法为粉碎后加入氨水对玉米秸秆进行预处理、接种6%绿色木霉(13001)产酶效率最高、添加15%纤维素酶曲水解24h纤维素水解最完全、加入氯化铵作为氮源发酵糖化效果最好,通过正交试验确定了单细胞蛋白发酵的最适工艺条件为加入3倍水,温度控制在29~31℃,起始pH控制在5.5左右,发酵时间48h左右。     

纤维素分解复合菌生物预处理秸秆优越性研究

通过驯化得来一组酶活较高较稳定的纤维素分解复合菌,使用该组复合菌和高效黄绿木霉分别预处理秸秆后再进行两相厌氧发酵。其中复合菌处理的实验组产气量比未处理组高33.3%,比木霉处理组高41.9%,甲烷转化率可达47.6%。实验结果表明,复合菌实际生产中有广阔前景。     

混合菌液态发酵纤维素酶及发酵pH的优化

以优势互补为原则,采用绿色木霉、根霉混合发酵产纤维素酶.利用旋转回归法研究根霉、绿色木霉混合发酵生产纤维素酶的比例、pH两个重要的影响因素,并拟合出回归方程.回归分析表明,发酵过程中,混合菌比例、pH对滤纸酶活具有显著影响.通过岭脊分析寻优得出:绿色木霉、根霉的混合比例为1∶1、发酵初始pH为3.5,在此优化条件下滤纸酶活由优化前的2.73 IU/mL、3.15 IU/mL提高到5.418 IU/mL.     

石油降解菌群的构建及室内修复石油污染土壤的研究

为生物修复石油污染的土壤,采用排列组合法以石油降解率为指标筛选出高效石油降解菌群,制备游离及固定化菌剂,室内模拟石油污染的土壤并进行生物修复实验,采用气相–质谱联用(GC-MS)技术分析降解前后石油成分的变化.结果表明:摇瓶培养条件下,由菌株10-1、10-2和10-3的种子浓缩液按体积比1﹕1﹕1的比例组成的10#菌群石油降解率最高(73.34%),且降解后除C18组分外,其他烷烃成分未被检出;在10%,的投菌量下,60,d后,10#菌群固定化菌剂组对室内石油污染土壤的石油降解率(32.5%)高于游离菌剂组(24.9%),且降解后其短链烷烃含量(11.42%)也高于游离菌剂组(7.91%)和空白组(5.12%).本文研究结果为10#菌群应用于野外石油污染土壤的修复奠定了基础.     

绿色木霉原生质体的制备与再生研究

以绿色木霉 (TrichodermaviridePers .exFr.)为研究对象 ,采用多因素实验正交优选法 ,对绿色木霉原生质体的制备和再生条件进行了研究 ,并对原生质体释放过程进行了形态观察 .结果表明 ,制备绿色木霉原生质体的最佳条件为 :菌龄为 11h ,用A培养基作生长培养基 ,5 % (w/w)蜗牛酶处理 ,酶解温度 30℃ ,0 .7mol/LKCl作渗透压稳定剂 ,在添加 10 %PEG(MW 6 0 0 0 )和 10mmol/LCaCl2 等再生促进因子的情况下 ,再生率可达 14 .6× 10 - 4;绿色木霉原生质体的释放方式为原位释放 ,原生质体平均直径为 6 .5 μm .     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

绿色木霉EG III基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

 通过RT PCR从绿色木霉AS33711中克隆得到EG III基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉 eg3 的同源性为99.6%。将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2489,通过SDS PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析。结果表明：转化子有明显的重组EG III表达带,能够产生CMC水解圈,说明 eg3 基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG III的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG III的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉 eg3 基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达。     

一株降解小麦秸秆丝状真菌的筛选、鉴定及初步研究

利用涂布平板法从腐烂秸秆及枯枝烂叶中分离出71株丝状真菌.通过比较菌株秸秆粉降解产物对小麦生长的促进作用,获得一株可有效降解秸秆并促进小麦生长的菌株2-5-2.对其进行形态分析和rRNA序列鉴定,结果显示,该菌株为木霉属真菌.该菌株可产生纤维素酶、木质素酶、半纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶、壳聚糖酶.平板对峙培养显示,该菌对多种病原真菌的生长有抑制或阻碍作用.固态发酵培养时,纤维素酶、半纤维素酶酶活在第11d达到最高;第28d,纤维素降解率达到21.13%,半纤维素降解率达到28.53%.     

绿色木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的克隆及其在酿酒酵母中的高效表达

采用RT-PCR 的方法从目前最高效的纤维素酶产生菌之一的绿色木霉AS3.3711中克隆得到纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）的编码基因cbh2。序列测定和分析表明,该编码序列长1416 bp,编码472个氨基酸残基,与已公布的绿色木霉CICC 13038的cbh2仅在第263位存在一个氨基酸残基的差别（Gln替换为Pro）,而与里氏木霉VTT-D-80133的cbh2则完全同源。该序列已经提交GenBank,登录号为 DQ864992。利用信号肽预测软件SignalP 3.0发现该基因自身带有信号肽序列,其最大可能的切割位点在18和19位氨基酸残基之间。将该基因片段接入酿酒酵母高拷贝数整合型表达载体pScIKP中,得到重组表达质粒pScIKP-cbh2。经酶切线性化后电转化酿酒酵母AS2.489菌株,通过G418浓度梯度筛选出高抗转化子。转化子经蛋白电泳分析,发现该基因的信号肽序列能够被酿酒酵母识别,因此重组CBHⅡ成功分泌到了胞外。但可能由于酿酒酵母表达系统的过度糖基化作用,重组CBHⅡ比出发菌绿色木霉的CBHⅡ分子量要高许多,并且可能因为过度糖基化作用位点不同而形成了不同大小分子量的表达产物。转化子经CMC糖化力法测定酶活,发现该重组CBHⅡ酶活性并没有受过度糖基化作用的影响,最高可达7.71 U/mL,比大多数报道的要高。其作用的最适pH值为5.0,最适温度为65 ℃,且具有较好的热稳定性。     

微生物降解稻草制取多种糖的研究

采用固态发酵的方式利用黑曲霉、康宁木霉、里氏木霉、绿色木霉、宇佐美曲霉5种真菌对稻草进行降解，利用高效液相色谱对降解产物中多种糖的种类与数量进行测定，为这些糖的继续利用提供参考价值。研究表明，稻草的降解产物中含有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和纤维二糖，其中葡萄糖占总糖的比例最大。     

不同预处理方法对秸秆固态发酵产纤维素酶的影响

以稻草秸秆为原料,经不同方法预处理后用于固态发酵产纤维素酶.以羧甲基纤维素酶(CMC)酶活力和滤纸酶(FPA)酶活力为指标,比较了不同预处理方法对后续绿色木酶固态发酵产纤维素酶的影响.研究结果表明,微波联合稀酸预处理秸秆最有利于发酵产纤维素酶,并通过正交试验得到了最佳的预处理条件:基质浓度7%,H2SO4浓度2%,在180W的微波功率下处理稻草5min.在此条件下得到的单位能耗的酶活增加量最高,CMC酶活和FPA酶活分别比未经处理的稻草发酵后所得酶活提高了135.6%和82.7%.     

绿色木霉TW-3菌株对绿豆立枯病的生物防治

通过盆栽和大田试验测定了绿色木霉(Trichoderma viride)TW-3菌株对幼苗期绿豆立枯病(Rhizoctonia solani)的生防效果,结果发现TW-3菌株可以有效防治绿豆立枯病,防治效果分别为87%～94%和81%～94%,优于多菌灵拌种的防治效果.利用平板法初步研究TW-3对绿豆立枯病菌的作用机制,发现TW-3菌株通过菌丝间缠绕,抑制绿豆立枯病菌的生长,表明重寄生作用在生物防治中具有重要作用.     

日本亮耳菌对植物病原真菌的拮抗试验

 首次报道了日本亮耳真菌对植物病原真菌的拮抗活性.结果表明:除对竹荪疫霉(Phytophthora sp.)的拮抗方式是菌丝缠绕作用外,该菌株的菌丝体及其发酵液滤液对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)和稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)均有很强的拮抗活性.     

耕作方法对土壤真菌数量和群落结构的影响

不同耕作方法对土壤真菌数量影响不大,但对真菌群落结构和种群构成却有显著的影响,翻耕0－10cm土层土壤真菌群落含有20种真菌,其中以Chrysosporium merdarium为优势种,Acremonium butyri为亚优势种;翻耕20－20cm土层含有17种真菌,以Sterile blackA为优势种,Stachyborys chartarum为亚优势种;翻耕20－30cm土层含有10种真菌,其中以Chaetomium bostrychodes为优势种,Sterile blackA为亚优势种,铁茬0－10cm含16种真菌,其中Sterile blackA是优势种,Chaetomium bostrychodes为亚优势种;铁茬10－20cm土层含有126种真菌,优势种为Sterile blackA,亚优势种为Talaromyces flavus,铁茬20－30cm含有14种真菌,其中Chaetomium bostrychodes为优势种,Talaromyces flavus为亚优势种,免耕0－10cm土层由23种真菌构成,Trichoderma viride和T.koningii为优势种,Talaromyces trachyspermus为亚优势种;免耕10－20cm土层由14个种类构成,Talaromyces trachyspermus为群优势种,Eupenicillium brefeldianum为亚优势种;免耕10－30cm土壤由9种真菌组成,其中Talaromyces trachyspermus为优势种。     

木霉对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的作用机理

木霉对棉花枯萎病菌(Fumrium oxysporum f.sp.Vasinfectum)的幼菌丝具有强烈的寄生能力，对于老熟菌丝的寄生能力较弱。木霉能够产生琼脂扩散性和挥发性抑菌物质。绿色木霉LTR-2产生的挥发性抑菌物质能强烈抑制棉花枯萎病菌的菌丝生长。木霉生物防治作用的另外一种方式是与病原菌竞争营养物质，研究发现葡萄糖是竞争对象之一。木霉具有很强的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性。培养液中添加几丁质、木霉菌或者棉花枯萎病菌菌丝干粉后培养木霉，培养液上清能够破坏枯萎病菌的菌丝尖端并导致原生质体的泄露，该现象主要与木霉的几丁质酶活性有关。木霉对棉花黄萎病菌具有相同的作用方式。