动物基因工程慢病毒载体--一种将传染性病毒颗粒转变成基因治疗的载体

慢病毒载体是一类逆转录载体,它既能感染分裂细胞,也能够感染非分裂细胞.也就是说,它能够广泛地应用于基因治疗,构建转基因动物和结合RNAi技术进行基因功能研究.     

慢病毒载体研究进展

慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展。本文就慢病毒载体及应用方面的研究进展作一综述。     

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.     

慢病毒及其载体系统研究进展

基于慢病毒的病毒载体的研究已经发展到一定水平,因此用慢病毒作为基因转移媒介的临床研究已经开始,在实验室和临床应用中,慢病毒具有特别的优点,尤其是能整合未分裂细胞的独特能力.现在基于HIV的慢病毒载体的临床研究已经开始应用于人体.本文介绍基于HIV-1的慢病毒和慢病毒载体的结构,慢病毒载体的优点以及慢病毒载体应用的展望.     

基因治疗中病毒载体的研究进展

目的:在基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段得到了迅速发展的同时,探讨病毒载体在基因治疗中的应用。方法:通过对各种病毒载体的改造和完善,扩大其载体容量,提高基因的转染效率和克服体内的免疫反应等手段,可使病毒载体的应用更加符合临床的需要。结果:改造过的病毒载体大大提高了载体靶向的特异性和应用范围。结论:病毒以其独特的生物学特性作为基因治疗载体有着独特优势,在临床上得到了广泛应用。     

基因治疗载体的研究进展

基因治疗已经开始用于肿瘤、癌症及各种遗传性疾病的治疗当中,临床效果已经开始显现,且应用前景广阔。基因治疗的关键是采用适宜的载体材料将外源基因传递至受体靶细胞中,本文总结了基因治疗中常用的病毒、非病毒载体,报道如下。     

用慢病毒载体介导产生绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠

以慢病毒（lentivirus）载体为骨架，携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的假病毒，通过小鼠受精卵卵周隙注射，将其感染小鼠受精卵，经移植于假孕母鼠后获得转基因小鼠．应用PCR、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等技术，证明了GFP基因的整合率达到40%以上；实时定量PCR分析结果表明转基因小鼠中GFP基因整合的拷贝数约为40；染色体荧光原位杂交分析结果显示GFP基因在小鼠染色体上的整合是随机的，并通过交配可将外源基因遗传至子代，获得的多整合位点和不同表达水平的转基因小鼠具有明显的实际应用和研究价值．文中报道的慢病毒载体介导的转基因技术为高效制备和选育高表达转基因小鼠品系提供了一种有效的途径．     

基因治疗中目的基因的导入方法

基因治疗正从实验室研究走向临床应用，它给医学界引入了一种全新的概念，基因治疗主要是利用病毒介导的基因转移。文中介绍了目前已应用和将要应用于人类基因治疗的逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体等的构建方法，优缺点和适于治疗的疾病。扼要地介绍了目的基因导入的理化方法。     

基因治疗中运用的载体系统

基因导入系统是基因治疗的核心技术,基因治疗面临的首要问题是载体的选择。阐述了基因治疗载体的种类、构建、生物学特性、各载体的优缺点及研究进展。     

基因治疗中运用的载体系统

基因导入系统是基因治疗的核心技术，基因治疗面临的首要问题是载体的选择。阐述了基因治疗栽体的种类、构建、生物学特性、各载体的优缺点及研究进展。     

HSV1-tk基因的部分DNA序列分析

采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＨＳＶ１０６扩增出ＨＳＶ１－ｔｋ基因（１１２８ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,然后以重组质粒ｐｃＴＫ为模板ｔｋ基因的５端引物为ＤＮＡ测序引物进行部分ＤＮＡ序列分析,部分ＤＮＡ序列分析证明ＰＣＲ产物为ＨＳＶ１－ｔｋ基因正确无误,成功筛选到ＨＳＶ１－ｔｋ基因的真核表达载体ｐｃＴＫ,并为利用ｔｋ基因在实验动物体内进行自杀性基     

Expression of human clotting factor Ⅸ mediated by recom- binant lentiviral vector in cultured cells and hemophilia B mice

Hemophilia B, a serious bleeding disorder, is an inherited X chromosome-linked disease for the deficiency or inactivity of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ). Though factor substitution therapy has greatly improved the lives of hemophiliac patients, there are still limitations to the current treatment, which have triggered interest in alternative treatments by gene therapy[1]. Based on preclinical studies in rabbits[2], our lab had first initiated an ex vivo gene therapy clinical trial whereby a…     

精子介导法生产转基因动物研究进展

精子介导基因转移是利用动物精子具有自发结合和内化转运外源DNA能力的特点,并使其在受精时导入卵每细胞,获得转基因动物。该方法具有操作简单、高效和适用等特点,但影响精子转染外源基因效率的因素很多,其中包括外源DNA、精子及转染方法等。     

转基因动物的应用与展望

转基因动物是生物工程中一个新兴领域．它在基因表达与调控的基础理论研究、贵重药物生产、建立人类疾病模型动物、生产供人类移植用器官、培育家畜新品种等多方面得到应用，并显示出极优越的应用前景。     

Non-viral gene carrier mediated short hairpin RNA interference for inhibition of tumor cells growth

A tumor-targeting gene vector G250mAb-PEI-PEG has been prepared by modification of polyethylenimine （PEI） with polyethyleneglycol （PEG） and G250, a monoclonal antibody against the G250 antigen on tumor cell surface. The transfection efficiency was as high as 70% in G250 positive HeLa cells, whereas the transfection efficiency was relatively low （30%） in normal NIH3T3 cells. A plasmid encoding the short hairpin RNA （shRNA） specific for nucleostemin gene （NS） was efficiently transfected into the HeLa cells with this nonviral gene vector. RNA interference down-regulated the expression of NS gene in HeLa cells, inhibited cells proliferation and induced apoptosis. However, the growth and activity of the NIH3T3 cells were not affected under the same treatment. These results indicate that the reported nonviral gene vector, G250mAb-PEI-PEG, can target and efficiently deliver genes into HeLa cells, and has the potential for the cervical cancer treatment.     

使用病毒载体的罕见病基因疗法临床进展

 很大一部分的罕见病由遗传因素决定,难以用普通的小分子或大分子药物治愈,而基因治疗有望从根本上修正人体功能的缺失或异常,给罕见病患者带来改善生活质量的希望。目前许多基因疗法的临床试验正在开展,病毒载体是常用的基因递送方法,本文讨论了用于临床基因递送的多种病毒载体,包括腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒,重点列举了这些病毒在罕见病临床试验中的研究、应用和进展,评价了这些病毒的优缺点,并简述了基因疗法的研究方向及应用前景。     

基因表达系统与转基因动物乳腺反应器

出于研究、医疗或工业目的，常常需要大量置备各种生物活性蛋白质，为此已经建立了多种基因工程表达系统，如微生物发酵系统、真核细胞培养系统、转基因植物表达系统和转基因动物表达系统等。近几年，利用转基因动物作为生物反应器由乳汁中生产蛋白药物的研究取得了很大进展，有多种动物可被用于转基因。基本过程是将基因构件显微注射到单细胞期受精卵，基因构件以一定几率整合到受体基因组中。通常转基因和其表达模式可忠实地遗传。许多蛋白将以高浓度低成本由转基因家畜的奶中生产。这些转基因动物与传统的动物细胞培养和细菌发酵技术相比尤显高效。乳腺能完成包括二硫桥形成、酰胺化、羧基化和糖基化在内的翻译后修饰，１头转基因羊就是１套发酵罐。据预测，到２０１０年由转基因动物生产的蛋白药物占全部基因工程药物的比率将增长到９５％以上。     

Expression of human clotting factor Ⅸ mediated by recom- binant lentiviral vector in cultured cells and hemophilia B mice

To explore the expression of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ) cDNA in vitro and the feasibility of gene therapy for hemophilia B mice mediated by recombinant lentiviral vector, a recombinant hFⅨ lentiviral vector driven by ubiquitin-C promoter, FUXW, and by ABP liver specific promoter, FAXW, was constructed respectively. Recombinant lentivirus was harvested from 293T cells by calcium phosphate-mediated transient cotransfection of three plasmids (transgene vector, CMV腞8.2, VSV-G). hFⅨ expression was detected in supernatant of 293T, BHK and L-02 cells infected with FUXW virus, whereas higher expression of hFⅨ levels (630 ng/106 cells/48 h) was detected only in L-02 cells infected with FAXW virus. Serum hFⅨ antigen was detected in all hemophilia B mice treated with FAXW virus by tail vein injection, an efficiency level of hFⅨ was observed (45 ng/mL, approximately 1% of normal human levels), the expression lasted for more than 60 d. The results indicated that HIV-based lentiviral vectors offer a promising approach to the gene therapy of hemophilia B.     

Progress in non-viral gene delivery systems fabricated via supramolecular assembly

Gene delivery systems are one of key issues that limit the development of gene therapy. The novel non-viral gene delivery systems fabricated via supramolecular assembly have begun to show increasing promising and applications in gene therapy due to its suitable nanometric size,controllable structure and excellent biocompatibility. In this review, the fundamental and recent progress of non-viral gene supramolecular assembly is reviewed. Artificial viruses the future direction of non-viral gene delivery systems are also described.